miR-29b對缺血損傷心肌細胞模型的自噬影響及分子機制研究

張 蕾，王 誠(.隴縣人民醫院心血管內科, 陜西寶雞 700;.寧強縣天津醫院心內科 ，陜西寧強 74400)

心肌缺血再灌注損傷為常見的心血管病，為心肌組織缺血導致局部心肌損傷，由于機體自身的代償機制實現缺血區域的再灌注，從而導致組織器官的進一步損傷[1-2]。該病的發生機制還不明確，涉及到免疫炎癥損傷、線粒體損傷、細胞凋亡、氧化應激損傷、興奮性氨基酸毒性等多種機制[3-4]。細胞自噬是指受損細胞器、錯誤折疊蛋白質產生的廢棄物被自噬小體包裹起來，并運送到溶酶體中進行消化與降解。當細胞受到外界刺激處于應激狀態時，自噬流被激活，可引起細胞內環境穩態紊亂，從而誘發心血管疾病的發生。微RNAs（microRNAs,miRNAs）在機體心血管疾病中有特定的表達譜，大鼠大腦中動脈栓塞模型中有上百個miRNAs 異常表達，說明miRNA 與心肌缺血再灌注損傷密切相關[5]。微RNA-29b(microRNA-29b, miR-29b)是一個與胚胎心血管系統的發育生長密切相關的miRNA，在心肌梗死大鼠中表達下降并可調節缺血性心肌損傷[6]。因此，本文探討與研究了miR-29b 對缺血損傷心肌細胞模型自噬的影響及分子機制，旨在為缺血損傷心肌損傷的預防治療提供新的途徑和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 研究時間為2019年1～2019年12月，心肌細胞系(H9C2)購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，在溫度為37℃，5%（v/v） CO2，濕潤的細胞培養箱中孵育。

1.2 儀器與試劑 培養基為含10ml/dl 胎牛血清(中國康源生物公司)的DMEM 高糖培養基(美國Gibco 公司)；胰蛋白酶購于美國Millipore 公司；酶標儀購自美國BD 公司；蛋白雜交與凝膠成像系統購自美國Bio-rad 公司；蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔抗β-actin，乏氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)，微管相關輕鏈蛋白-3(microtubule associated protein light chain3,LC-3)多克隆抗體購自美國Abcam 公司；超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)與丙二醛(malondialdehyde, MAD)檢測試劑盒購自南京建成生物技術有限公司;miR-29b 與miR-NC 購自上海吉瑪生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 缺血損傷心肌細胞建立與分組：所有H9C2細胞先用PBS(Gibco 公司)清洗細胞2 次，加入用95%（v/v） N2+5%（v/v） CO2置換30min 的無糖DMEM，置于37℃，94%N2+1%（v/v） O2+5%（v/v）CO2低氧培養箱中缺氧培養8h，然后放入37℃，5%（v/v） CO2細胞培養箱給予復氧24h。將已經建立缺氧/復氧模型的H9C2細胞隨機分為三組：空白組、對照組與實驗組。

1.3.2 細胞轉染方法：待細胞貼壁生長融合度達80%～90% 時，空白組、對照組與實驗組以life2000TM為載體體外轉染PBS，miR-NC 與miR-29b 等，轉染后終濃度均為50nmol/L/孔，轉染后4～6h 換液。

1.3.3 熒光定量PCR 檢測方法：收集心肌細胞用Trizol 提取總RNA，逆轉錄后采用SYBR-Green 染料法進行定量PCR，反應條件為：95℃ 2min；95℃15s，60℃32s，40 個循環，檢測結果以2-ΔΔCt值進行。

1.3.4 Western blot 檢測方法：細胞收集后用PBS洗滌2 次，加入RIPA buffer 裂解細胞，蛋白樣品定量后，于10g/dl SDS-PAGE 上進行分離，并電轉至PVDF 膜上，采用5g/dl 脫脂奶粉封閉過夜，加入稀釋到合適濃度的一抗，4℃孵育過夜，清洗后加入辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗，37℃孵育2h，清洗后采用化學發光檢測底物，顯影檢測。

1.3.5 細胞增殖檢測：將細胞消化后配成單個細胞懸液，調整好活細胞的濃度接種到96 孔板，培養24h 后每孔加入100μl 不同濃度的樣品，培養特定的時間以后，每孔加MTT 溶液20μl，繼續孵育4h 后吸棄上清液，每孔加150μl DMSO，振蕩培養10min，選擇490nm 波長，在酶標儀上測定吸光度，計算細胞增殖指數。

1.3.6 SOD 活力與MDA 含量檢測：取細胞上清，采用酶聯免疫法檢測SOD 活力與MDA 含量。上述實驗都重復3 次，取平均值。

1.4 統計學分析 選擇SPSS20.00 軟件對本研究所有數據進行分析，數據錄入和處理均按照各個實驗設計要求，符合正態分布的計量數據使用均數±標準差(±s)表示，兩兩對比采用t 檢驗，多組間對比采用單因素方差分析等，非正態分布數據采用非參數檢驗方法，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 miR-29b mRNA 表達及細胞增殖水平對比 見表1。 細胞轉染后24h 與36h， 三 組miR-29b mRNA 表達水平、細胞增殖指數相比差異有統計學意義（P ＜0.05），其中實驗組與空白組及對照組相比差異有統計學意義（P ＜0.05），空白組與對照組對比差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表1 轉染后不同時間點miR-29b mRNA 表達及細胞增殖指數水平對比(±s)

注：*miR-29b mRNA 表達水平24h vs 36h ，t=59.566，P=0.000，差異有統計學意義。

指標 實驗組 對照組 空白組 F P miR-29b mRNA 表達水平 24 h 56.33±10.11* 0.92±0.13 0.95±0.11 45.284 0.000 36 h 78.34±10.09 * 0.93±0.12 0.96±0.18 59.882 0.000細胞增殖指數 24 h 1.33±0.11 3.45±0.13 3.44±0.21 9.284 0.001 36 h 1.34±0.09 3.44±0.12 3.48±0.18 81.871 0.000

2.2 HIF-1α，LC-3 蛋白相對表達量及SOD，MDA 水平對比 見表2。細胞轉染后24h 與36h，三組HIF-1α，LC-3 蛋白相對表達量及SOD 活力、MDA 含量相比差異具有統計學意義（P ＜0.05），其中實驗組與空白組及對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，空白組與對照組對比差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表2 轉染后不同時間點HIF-1α，LC-3 蛋白相對表達量及SOD, MDA 水平對比(±s)

表2 轉染后不同時間點HIF-1α，LC-3 蛋白相對表達量及SOD, MDA 水平對比(±s)

注：*HIF-1α，LC-3 蛋白相對表達量24h vs 36h，t=7.048, 10.306, P=0.02, 0.009,差異有統計學意義。

指標 實驗組 對照組 空白組 F P HIF-1α 24 h 4.54±0.33* 1.09±0.22 1.00±0.09 13.493 0.000 36 h 5.72±0.44* 1.34±0.16 1.21±0.11 12.898 0.000 LC-3 24 h 4.51±0.25 * 1.11±0.17 1.13±0.09 12.223 0.000 36 h 5.70±0.32* 1.37±0.18 1.32±0.09 15.693 0.000 SOD(U/mg) 24h 8.24±0.66 2.33±0.19 2.33±0.11 9.133 0.001 36h 8.56±0.51 2.49±0.18 2.28±0.09 9.672 0.000 MDA(μmol/g 24h 44.59±4.10 79.87±3.17 80.22±6.28 12.482 0.000 36h 44.09±4.41 80.09±3.19 80.98±5.67 10.093 0.000

3 討論

心血管疾病是嚴重危害人體健康的主要疾病之一，具有死亡率高、發病危急、起病重和預后差等特點，其中心肌缺血/再灌注損傷為主要的心血管疾病[7]。當機體的心肌組織受到缺血等刺激時，可啟動內源性抗氧化與抗缺血機制，保護瀕臨死亡的心肌細胞，促進心功能的恢復[8]。而在缺血再灌注過程中，損傷機制占絕對優勢，保護性介質水平與持續作用時間有限，從而造成心肌組織的繼發性損傷[9]。miRNAs 是一類長度約為23nt 的保守的小RNA，能夠在轉錄后水平調控基因的表達，從而參與細胞生長、增殖、凋亡、分化的調控。miR-29b定位于染色體lq32.2，是在心肌缺血再灌注損傷中出現明顯上調表達的miRNA 之一，在成肌細胞的增殖和分化的調節過程中起著中心作用，也可由各種各樣的轉錄調節者和信號通路所調節[10-11]。有研究顯示[12]，miR-29b 的過表達對心肌細胞具有保護作用，而低表達更易導致心血管損傷。

本研究顯示細胞轉染后24h 與36h，實驗組的miR-29b mRNA 表達水平顯著高于空白組與對照組，空白組與對照組對比差異無統計學意義(P＜0.05)。細胞轉染后24h 與36h，實驗組的SOD活力顯著高于對照組與空白組(P＜0.05)，MDA 含量顯著低于對照組與空白組(P＜0.05)，對照組與空白組對比差異無統計學意義(P＞0.05)。SOD 活力增加不但能顯著減輕心肌組織損害程度，而且也具有重要的預防性腦保護作用，以及改善相關并發癥[13]。而MDA 是細胞膜脂質被活性氧氧化后的副產物，MDA 含量降低可使得機體氧化應激損傷作用減少；而提高miR-29b 表達能清除心肌缺血再灌注損傷所產生的氧化應激產物，并提高抗氧化酶活性[14]。高英英[15]的研究顯示，miR-29b 表達上調可減少缺血再灌注損傷引起的心肌細胞凋亡，與本研究結果一致。miRNAs 通過RNA 誘導的沉默復合體來調節靶基因的降解和/或翻譯抑制。目前認為miRNAs直接調控哺乳動物基因組中1/3 以上基因的表達，特別是miRNAs 的異常表達與心血管病的發生發展密切相關[16]。本研究顯示細胞轉染后24h 與36h，實驗組的細胞增殖指數顯著低于空白組與對照組(P＜0.05)，空白組與對照組對比差異無統計學意義(P＞0.05)，表明促進miR-29b 的表達能促進心肌細胞增殖。

氧化應激是心肌缺血再灌注損傷的最主要因素，過度累積的氧自由基還可增加細胞通透性，引起鈣離子內流發生交換障礙，誘發心律失常的發生。HIF-1α 是缺氧誘導因子家族的一員，在缺氧時上調表達以適應缺氧環境[17-18]。正常的心臟組織保留著低水平的自噬，保障細胞的能量與物質代謝。在心肌缺血再灌注過程中，自噬可導致心肌細胞降解過度，加重心肌損傷。過度激活的自噬流可加快心肌細胞的死亡，如何控制細胞自噬處于平衡的狀態，使其向著保護心肌細胞的方向發展具有重要價值[19-20]。本研究顯示細胞轉染后24h 與36h，實驗組的HIF-1α，LC-3 蛋白相對表達量顯著高于空白組與對照組P＜0.05，空白組與對照組對比差異無統計學意義(P＞0.05)，表明miR-29b 的過表達可以調控HIF-1α，LC-3 蛋白的相對表達，從而影響心肌細胞的自噬與氧化應激水平。不過本研究沒有明確miR-29b 的直接作用靶基因，對信號通路的調控分析不還夠深入，下一步的實驗將著重于相關信號通路分析。

總之，miR-29b 能通過正向調節HIF-1α，LC-3 蛋白的相對表達量來提高SOD 活性，降低MDA 含量，從而促進細胞自噬，發揮對缺血損傷心肌細胞的保護作用。