鹽酸普萘洛爾對十二指腸潰瘍模型大鼠的作用及其機制的實驗研究

舒俊偉，牛智平，杜嘉原(安康市人民醫(yī)院普外科, 陜西安康 725000)

十二指腸潰瘍(duodenal ulcer, DU)是一種消化系統(tǒng)多發(fā)病，其病程較長且易反復(fù)發(fā)作，嚴重影響患者日常生活?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，DU 是侵襲力(包括胃酸分泌過多和氧化壓力過高)高于防御力時導(dǎo)致十二指腸黏膜受損形成的潰瘍[1-2]。目前DU 治療方法主要有非手術(shù)治療和外科手術(shù)治療兩種，但由于對DU 的病因、發(fā)病機制缺乏認知，在臨床實踐中常存在治療效果不佳等問題。早期已有研究指出維拉帕米(Verapamil, VR)對半胱胺誘導(dǎo)的DU 大鼠具有保護作用[3]，VR 和鹽酸普萘洛爾均可在臨床上用于心律失常和心絞痛等疾病的治療。但是關(guān)于鹽酸普萘洛爾在DU 中應(yīng)用的報道鮮有。鹽酸普萘洛爾是非選擇性β-腎上腺素能受體的抑制劑，其具有阻斷血管生成過程和誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細胞凋亡等作用[4-5]。本研究選取經(jīng)典的半胱胺致DU 大鼠模型，探究鹽酸普萘洛爾對DU 大鼠十二指腸黏膜的保護作用及其對抗氧化酶和IGF-1/PTEN/Akt信號通路的影響，以期為臨床診療提供新思路，現(xiàn)具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠35 只，SPF 級，雌雄各半，體質(zhì)量為210±10 g，均購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。大鼠適應(yīng)7 天后開始實驗。飼養(yǎng)房濕度控制在50%～70%，溫度控制在20 ～25℃，噪音控制在60 dB 以下。飼料為60℃滅菌后的全營養(yǎng)飼料，12 h 明暗交替循環(huán)照明。

1.2 儀器與試劑 顯微鏡購于尼康儀器(上海)有限公司，鹽酸普萘洛爾片購于山東健康藥業(yè)有限公司，半胱胺購自德國Merck 公司。丙二醛(malonaldehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors -1,IGF-1)、PTEN 基 因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten, PTEN) 和α-tubulin 一抗及相應(yīng)的二抗均購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)。

1.3 方法 實驗分組與建模：大鼠隨機分為5 組，每組7 只，分別為對照組、十二指腸潰瘍模型組(模型組)、低劑量組(模型組+1 mg/kg 鹽酸普萘洛爾)、中劑量組(模型組+3 mg/kg 鹽酸普萘洛爾)和高劑量組(模型組+9 mg/kg 鹽酸普萘洛爾)，其中對照組大鼠灌胃給予1 ml/kg 生理鹽水，模型組大鼠灌胃給予450 mg/kg 半胱胺，低、中和高劑量鹽酸普萘洛爾組大鼠先用相應(yīng)濃度的鹽酸普萘洛爾預(yù)處理，再灌胃給予450 mg/kg 半胱胺[6]。24 h 后用脫頸法處死實驗大鼠，剖腹取出十二指腸，觀察其損傷情況并且對其進行檢測分析。

Western Blot 檢測：分別取各組大鼠約0.1 g 的組織并置于研缽中，加入液氮快速充分研磨，再加入裂解液，用蛋白定量試劑盒定量測定蛋白濃度。取50～100 μg 總蛋白，與上樣緩沖液混合均勻 (×5)，在沸水浴中加熱5 min，使蛋白充分變性后上樣。采用聚丙烯酰胺凝膠（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）電泳(分離膠120V和濃縮膠80V)，轉(zhuǎn)膜2 h。用TBST 配制含5 g/dl脫脂奶粉封閉緩沖液后加入一抗，4℃過夜。TBST漂洗液洗膜3 次15 min，加入辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗，37℃振蕩孵育60 min。室溫下將膜置于ECL 發(fā)光液中振蕩孵育3 min，最后應(yīng)用Image Pro Plus (IPP)軟件分析掃描圖像目的條帶的灰度。

大鼠的十二指腸黏膜損傷程度的評價：對5 組大鼠的十二指腸黏膜損傷程度采用改良的moraes方法進行評價，具體是：0 分表示十二指腸黏膜正常；1 分表示黏膜出現(xiàn)充血、水腫；2 分表示黏膜出現(xiàn)糜爛、出血；3 分表示黏膜損傷發(fā)展為淺潰瘍；4 分表示黏膜損傷發(fā)展為深潰瘍；5 分表示黏膜出現(xiàn)潰瘍穿孔。

組織病理學(xué)評價：將動脈組織挑入包埋劑中，置于烤箱中40℃過夜。次日升溫至60℃，48 h 后取出，然后將動脈蠟塊切成5 μm 的薄片，用二甲苯進行脫蠟處理共2 次，再依次使用75%，80%，85%，90%，95%，100%的乙醇進行梯度脫水共2次，3 min/次。蒸餾水漂洗后用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin, HE），蒸餾水漂洗后依次用100%，90%，80%的乙醇梯度脫水 2 min，二甲苯透明處理10 min 后用中性樹膠來封固，染色成功后在光鏡下觀察切片的組織形態(tài)。

大鼠的抗氧化酶系的測定方法：取十二指腸組織0.5 g，加入生理鹽水12 000 r/min 離心15 min后取上清液并保存在-80℃?zhèn)溆?。SOD，MDA 和GSH-Px 的檢測嚴格參照相應(yīng)說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS 11.5 統(tǒng)計學(xué)軟件。對于符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，并進行單因素方差分析(ANOVA)F 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠十二指腸中Akt，IGF-1 和PTEN 的蛋白相對表達量 見圖1。采用Western Blot 方法檢測各分組大鼠十二指腸中IGF-1/PTEN/Akt 信號通路相關(guān)蛋白的表達水平。與對照組相比，模型組Akt，PTEN 和IGF-1 的蛋白相對表達量顯著降低。與模型組相比，不同劑量鹽酸普萘洛爾組Akt，PTEN 和IGF-1 的蛋白相對表達量顯著升高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=10.319, P ＜0.01)。

圖1 各組大鼠十二指腸中Akt,IGF-1 和PTEN 的蛋白相對表達量

2.2 各組大鼠十二指腸黏膜損傷程度的比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和對照組大鼠腸黏膜損傷程度(±s，分)依次為4.06±2.18，2.08±1.67，1.79±1.25，1.50±1.03 和0。模型組大鼠的腸黏膜損傷程度顯著高于對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P ＜0.05)。低、中和高劑量鹽酸普萘洛爾組大鼠的十二指腸黏膜損傷程度依次降低且均顯著低于模型組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.703, P ＜0.05)。

2.3 各組大鼠的HE 染色結(jié)果 見圖2。模型組大鼠十二指腸黏膜及黏膜下層完全破壞，隨著鹽酸普萘洛爾濃度的升高，大鼠的十二指腸黏膜損傷程度逐漸降低。

圖2 各組大鼠的HE 染色結(jié)果

2.4 各組大鼠十二指腸的SOD，GSH-Px 和MDA比較 見表1。低、中和高劑量鹽酸普萘洛爾組大鼠的SOD 均高于模型組，高劑量組與模型組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=58.843，P=0.000)。低、中和高劑量鹽酸普萘洛爾組大鼠的GSH-Px 水平均高于模型組，高劑量組與模型組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.026，P=0.001)。低、中和高劑量鹽酸普萘洛爾組大鼠的MDA 水平均低于模型組，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.519，P=0.479)。

表1 各組大鼠十二指腸的SOD、GSH-Px 和MDA 的比較

3 討論

DU 是消化系統(tǒng)的常見疾病，與胃酸分泌異常、幽門螺桿菌(H.pylori)感染[7]、非甾體抗炎藥、生活及飲食不規(guī)律、工作及外界壓力、吸煙以及精神心理因素密切相關(guān)。近年來DU 的發(fā)病率呈逐漸攀升趨勢，嚴重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量。目前如何有效控制潰瘍的發(fā)展、減輕潰瘍的程度仍是DU 臨床和基礎(chǔ)研究的壁壘。

本研究采用半胱胺建立DU 大鼠模型，主要是由于半胱胺所致的潰瘍存在部位選擇性，一般情況下位于十二指腸近端，這種形態(tài)學(xué)上的變化與人類的DU 類似[8]。因此基于此可作為藥物藥效和作用機制評價的有效基礎(chǔ)。

IGF-1 是由70 個氨基酸組成的單肽，其在細胞增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[9-10]。NGUYEN 等[11]人發(fā)現(xiàn)IGF-1 可通過激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）加強潰瘍組織表皮細胞的再生作用。PTEN 是第一個具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性的抑癌基因，其具有促進細胞凋亡、參與調(diào)控細胞周期、抑制血管生成和細胞黏附等作用[12-13]。本研究結(jié)果顯示與模型組比較，不同劑量鹽酸普萘洛爾組Akt，PTEN 和IGF-1 的蛋白相對表達量顯著升高。

本研究比較各組大鼠十二指腸黏膜損傷程度結(jié)果說明模型組的黏膜損傷程度顯著高于對照組，這就說明建模是成功且可用的。低、中和高劑量鹽酸普萘洛爾組的十二指腸黏膜損傷程度顯著低于模型組，說明鹽酸普萘洛爾可有效降低十二指腸黏膜的損傷程度，另外隨著劑量的增加，黏膜損傷程度呈減輕趨勢，另外HE 染色再次驗證了這一結(jié)論。

活性氧（reactive oxygen species, ROS）會對蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子產(chǎn)生損傷作用。當(dāng)ROS 對細胞產(chǎn)生氧化損傷時，細胞內(nèi)固有的一套抗氧化防御體系將被激活。常見的抗氧化酶有MDA，谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等，MDA 作為脂質(zhì)過氧化損傷的重要標(biāo)志，其可影響膜結(jié)構(gòu)和功能。GSH-Px 可催化GSH 變?yōu)檠趸虶SH，使有毒的過氧化物還原成為無毒的羥基化合物，同時促進過氧化氫的分解，從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的損害[14-15]。十二指腸抗氧化酶系比較結(jié)果顯示低、中和高劑量鹽酸普萘洛爾組大鼠的SOD 和GSH-Px 水平顯著升高，MDA水平降低，這就可以說明鹽酸普萘洛爾對半胱胺致DU 大鼠具有保護作用并且與抗氧化有關(guān)。

綜上所述，鹽酸普萘洛爾可降低半胱胺致DU大鼠十二指腸黏膜的損傷程度，并且隨著劑量的增加，黏膜損傷程度逐漸減輕。鹽酸普萘洛爾通過IGF-1/PTEN/Akt 信號通路對DU 大鼠發(fā)揮保護作用，并且其作用可能與抗氧化有關(guān)。