兒童慢性ITP外周血CD3+T細(xì)胞活性氧的檢測及臨床意義

宋 麗，杜寧超，李富榮（.深圳市人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣州 深圳 5800；.深圳市第二人民醫(yī)院肛腸外科，廣州 深圳 58035）

特發(fā)性血小板減少性紫癜 (idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP) 是一種原因不明的自身免疫病，以血小板和巨核細(xì)胞自身抗體產(chǎn)生及成熟血小板破壞增多為主要病理特征,以及因此引起的皮膚、黏膜或內(nèi)臟出血為主要臨床癥狀的一類血液系統(tǒng)疾病[1]。ITP 患兒體內(nèi)有T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等的激活，白細(xì)胞分化抗原如CD3+(cluster differentiation，CD)T 細(xì)胞等。細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要在線粒體中產(chǎn)生[2]，具有較強的氧化能力[3]?？傊?，大量產(chǎn)生的ROS 對許多先天免疫細(xì)胞殺死吞噬的病原體至關(guān)重要[4]。在病理因素的誘導(dǎo)下這些吞噬細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的ROS，吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 可以到達(dá)T 細(xì)胞并導(dǎo)致氧化應(yīng)激。在兒童慢性ITP 中，CD3+T 細(xì)胞的ROS 含量及其與兒童慢性ITP 的關(guān)系尚不明確。本研究以慢性ITP患兒及正常兒童的外周血為研究對象，分離外周血CD3+T 細(xì)胞來檢測其ROS 的表達(dá)含量及ITP 與ROS 的關(guān)系，并探討了ROS 作為 ITP 潛在診斷靶標(biāo)的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 見表1。收集我院 2018年 1月～2019年12月30 例慢性ITP 患兒外周血為試驗組，其中男童14 例，女童16 例，年齡5.3±2.6 歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2016年版ITP 診治的中國專家共識指南；對照組為同期經(jīng)臨床和實驗室檢查，證明無疾病的健康體檢兒童外周血30 例，其中男童13 例，女童17 例，年齡5.4±2.0 歲。

表1 兒童慢性ITP 組和對照組一般資料比較（±s）

表1 兒童慢性ITP 組和對照組一般資料比較（±s）

類 別 慢性ITP 組（n=30）正常對照組(n=30) P體重指數(shù) (kg/m2) 18.3±1.7 17.6±2.2 0.32心率（次/min） 85±7 81±8 0.27體溫（℃） 37.2±0.6 37.1±0.8 0.85呼吸頻率（次/min） 17±3 18±2 0.67

1.2 主要試劑和儀器 人CD3+T Cell Enrichment Column （美國BD 公司），anti-CD3-FITC，MsIgG1- FITC，D-Hanks 緩沖液（美國 Sigma 公司），淋巴細(xì)胞分離液（天津灝洋生物制品有限公司），2g/dl 臺盼藍(lán)染液、PBS 緩沖液(pH7.2～ pH 7.6)（自配），紅細(xì)胞裂解液（美國 ThermoFisher公司），胎牛血清（FBS）（杭州四季清公司），BD-LSRFortessa（BD Biosciences），LD5-2A 型 低速水平離心機（北京醫(yī)用離心機廠），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），微量加樣器（德國Eppendorf 公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 外周血CD3+T 細(xì)胞純度和活性檢測:為了驗證所提取的CD3+T 細(xì)胞的活性和純度[5]，我們按如下方法操作：①取慢性ITP 患兒及對照組靜脈血4 ml 抗凝，Hanks 液稀釋1 倍，再加入淋巴細(xì)胞分離液中。②2 000 r/min 離心30min，液體分為三層，吸取上層和中層液界面處乳白色液體即為單核細(xì)胞。③該單核細(xì)胞37℃ 孵育30min，淋巴細(xì)胞懸浮，單核細(xì)胞貼壁，吸取懸浮液為純化的淋巴細(xì)胞。④Hanks 液稀釋此淋巴液5 倍，1 500 r/min 離心10min，棄上清液再裂解紅細(xì)胞，棄上清。⑤經(jīng)T 淋巴細(xì)胞分離柱(CD3+T cell enrichment column)過濾，得到純化的T 淋巴細(xì)胞懸液。⑥1 500 r/min離心10min，Hanks 液重懸并細(xì)胞計數(shù)，計數(shù)后加入FBS 調(diào)整CD3+T 細(xì)胞濃度至2×106/ml。

CD3+T 細(xì)胞純度檢測：取細(xì)胞懸液100 μl，加2 μl FITC 標(biāo)記的CD3+T 細(xì)胞單克隆抗體，充分混勻，4℃避光60 min，PBS 洗滌并離心2 次，加入200 μl 緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測。

CD3+T 細(xì)胞活性檢測：取20μl 細(xì)胞懸液加入20μl 2g/dl 臺盼藍(lán)染液，輕輕吹打均勻，加蓋玻片，高倍顯微鏡鏡檢，正常活細(xì)胞不著色，折光強；死亡細(xì)胞被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色，體積膨大，據(jù)此計數(shù)判斷CD3+T 細(xì)胞的活性。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)C）檢測外周血CD3+T 細(xì)胞ROS：按試劑盒說明書操作，用FC 檢測CD3+T 細(xì)胞ROS[6]。具體操作步驟如下：①熒光探針檢測；②樣品處理；③DCFH-DA（活性氧檢測試劑）標(biāo)記及檢測；④上流式機檢測分析。DCFH-DA 的熒光光譜和 FITC 非常相似，用 FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCFH-DA。

2 結(jié)果

2.1 患兒血細(xì)胞檢測結(jié)果 見表2。兩組患兒的血細(xì)胞檢測，發(fā)現(xiàn)除血小板有明顯差異外（t=3.58,P＜0.05），其他血細(xì)胞檢測指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.89～1.20，均P＜0.05）。

表2 兒童慢性ITP 組和對照組血常規(guī)比較（±s）

檢測指標(biāo) 慢性ITP 組（n=30）正常對照組(n=30) P白細(xì)胞(×109/L) 6.1±2.0 6.7±2.8 0.24紅細(xì)胞(×1012/L) 4.5±0.4 6.7±0.7 0.11血紅蛋白（g/L） 133±11 156±9 0.09血小板(×109/L) 25.5±12.2 186.1±14.7 0.007

2.2 T 細(xì)胞存活率和純度檢測結(jié)果 我們運用FC檢測CD3+T 細(xì)胞懸液純度，鏡下計數(shù)測得兩組T細(xì)胞懸液試驗組和對照組外周血T 細(xì)胞純度分別為95.6%±2.4%，96.5%±1.3%；兩組的T 細(xì)胞的存活率分別為97.3%±1.6%，96.0%±1.8%。兩組的T 細(xì)胞純度和存活率之間無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 外周血CD3+T 細(xì)胞及其ROS 與正常對照組相比，試驗組外周血CD3+T 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.70，P ＜0.05），見圖1。運用FC 檢測CD3+T 細(xì)胞的ROS 水平，與正常對照組相比，慢性ITP 患者外周血相同數(shù)量CD3+T 細(xì)胞ROS 的水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.45，P ＜0.05），見圖2。FC 檢測CD3+T 細(xì)胞ROS 的變化試驗組平均熒光強度（Mean fluorescence intensity, MFI）為15.98±5.78，對照組為4.65±1.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.956，P=0.003）。見圖3。

圖1 CD3+ T 細(xì)胞流式圖

圖2 FITC-CD3 單抗設(shè)門檢測ROS

圖3 ROS 熒光強度定量分析柱狀圖（CITP ∶慢性ITP）

2.4 慢性ITP 組外周血CD3+T 細(xì)胞ROS 水平與血小板的相關(guān)性分析 基于試驗組ROS 明顯升高和血小板降低，我們對二者的關(guān)系進(jìn)行了分析。見圖4 所示，慢性ITP 組外周血CD3+T 細(xì)胞ROS 的水平明顯增高，而血小板數(shù)量明顯降低，二者有相關(guān)性，呈負(fù)性相關(guān)（r2=-0.860 1，P ＜0.05）。

3 討論

ITP 是一種自限性疾病，患兒大多在6 個月內(nèi)可以痊愈，約10%～20%發(fā)展為慢性。ITP 高發(fā)年齡段為4～5 歲[7]，無明顯性別和季節(jié)差異。ITP 血小板的破壞與淋巴細(xì)胞等的激活以及與抗血小板自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)。研究也表明ITP 患者存在細(xì)胞免疫的異常，尤其與T 細(xì)胞功能改變有關(guān)，如CD3+T 細(xì)胞等。也有研究表明T 細(xì)胞識別人類血小板抗原(human platelet antigen，HPA)表位，進(jìn)而活化產(chǎn)生細(xì)胞因子，激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體[8]破壞自身血小板。

圖4 慢性ITP 組與ROS 與血小板的相關(guān)性分析

研究發(fā)現(xiàn)ROS 與ITP，炎癥、腫瘤、自身免疫病等有關(guān)[9]。ROS 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)涉及多個過程，如細(xì)胞生長、死亡[10-11]等。 ROS 可以細(xì)胞調(diào)控活化信號,進(jìn)而影響血小板功能[12]。ST 段抬高型心肌梗死患者血小板中趨化因子CCL2 表達(dá)增高,通過NF-κB 信號通路影響血小板功能參與血栓形成[13]；ROS 在NF-κB 信號通路上游發(fā)揮作用激活I(lǐng)kB 激酶復(fù)合物（IKK），從其抑制劑（IkB）中釋放NFκB，激活細(xì)胞相關(guān)的信號通路[14]。國內(nèi)有研究表明T 細(xì)胞CD4+Th 亞群功能改變、異常激活和凋亡等，參與了ITP 血小板的破壞機制[15]。但CD3+T細(xì)胞的ROS 與兒童慢性ITP 的關(guān)系尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)慢性ITP 患兒外周血CD3+T 細(xì)胞數(shù)量增加，其ROS 含量明顯升高，同時伴有血小板數(shù)量的明顯降低，發(fā)現(xiàn)ROS 和血小板二者之間存在負(fù)性相關(guān)關(guān)系，提示ROS 可能參與了慢性ITP血小板的破壞。根據(jù)我們的實驗結(jié)果，可以推斷在慢性ITP 中T 細(xì)胞特別是CD3+T 細(xì)胞可能被激活且產(chǎn)生大量ROS，ROS 作用在血小板的靶點可能是NF-κB 的通路如IκB，P65 或磷酸化P65 等，通過其氧化作用影響磷酸化或乙?；饔?，進(jìn)而激活NF-κB 通路，加速了血小板的凋亡或壞死，最終導(dǎo)致患兒慢性ITP 的發(fā)生或發(fā)展。但ROS 可能抑制CD3+T 細(xì)胞的凋亡使其數(shù)量增加，這與我們的研究結(jié)果一致，但其機理需要進(jìn)一步研究。B 細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的ROS 可能也參與慢性ITP 的發(fā)展，在多種因素的共同作用下決定了ROS 對血小板的生成及破壞的影響，最終決定了慢性ITP 的轉(zhuǎn)歸與結(jié)局。

綜上所述，慢性ITP 患兒外周血CD3+T 細(xì)胞的ROS 對血小板的破壞關(guān)系密切，可以作為慢性ITP 的診斷和治療的潛在靶點，為臨床工作提供一定的參考價值。同時，后續(xù)研究需進(jìn)一步擴大樣本量，研究ROS 對血小板信號通路及其結(jié)合位點的影響，以期更深入的研究ROS 對慢性ITP 血小板的破壞機制。