全自動酶免分析儀和酶標板快速孵育器聯合進行ELISA檢測操作其時間流程優化的實用性探討

韓小娟，趙 玥，田洪倫，何 軍

（1.貴州省第二人民醫院檢驗科，貴陽 550004；2.溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院，浙江溫州 325035）

酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有簡便、快速、成本低等優點而被臨床廣泛運用[1-3]。近年來，由于全自動酶免分析儀能減少人工成本及人為操作誤差，使檢測流程更加標準和規范，提高檢測結果的精確性和可溯源性，因此在臨床檢驗中受到廣泛應用。但全自動酶免儀樣本孵育時間長，影響臨床樣本檢測效率。酶標板快速孵育器因能縮短孵育時間，提高工作效率，在臨床檢驗中的應用越來越多，但快速孵育法仍需要人工加樣，增加了人工參與造成的誤差。本實驗通過利用全自動酶免分析儀聯合酶標板快速孵育器檢測乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），探討優化ELISA 操作流程在臨床檢驗中的實用性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月～2019年9月經化學發光法定量檢測HBsAg 陽性高值（≥250 IU/ml）、中 值（101～250 IU/ml）、低 值（0.05～100 IU/ml）樣本各50 例，HBsAg 陰性樣本50 例。其中男性112 例，女性88 例，年齡4 ～93 歲，平均年齡46 歲。

1.2 儀器與試劑 四川邁克i3000 化學發光免疫分析儀，嘉興科瑞迪全自動酶聯免疫分析儀（HB-500E)，成都蓋森酶標板快速孵育器（MKF-6)。邁克生物股份有限公司化學發光法乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒，北京萬泰生物藥業有限公司酶聯免疫法乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 所有收集的血清樣本均保存于-80℃低溫冰箱中直至分析。取出待檢樣本置于室溫至完全融化混勻，待測。

1.3.2 化學發光法定量檢測HBsAg (C 法)： 按照邁克生物股份有限公司乙型肝炎病毒表面抗原檢測試劑盒說明書和儀器SOP 操作，并嚴格執行質控標準。

1.3.3 ELISA 定性檢測HBsAg：試劑盒室溫放置30min 后分別用四種實驗方法檢測，A 法：使用全自動酶免分析儀進行孵育檢測；B1，B2，B3 法：均使用全自動酶免分析儀加樣、加試劑、洗板、比色，孵育時轉移到酶標板快速孵育器進行孵育，其中B1 法孵育時間為說明書規定時間的1/2，B2法孵育時間為說明書規定時間的1/3，B3 法孵育時間為說明書規定時間的1/4，具體孵育時間見表1，其他操作步驟嚴格遵守試劑盒說明書和儀器SOP 進行。

1.3.4 計算每份樣本的S/CO 值：以S/CO 值≥1時判斷為樣本HBsAg 陽性，S/CO 值＜1 時判斷為樣本HBsAg 陰性。A，B1，B2，B3 法分別與化學發光法（C 法）進行差異比較，同時計算各方法的總樣本符合率、敏感度和特異度。

表1 各方法實驗孵育時間

1.3.5 精密度評價實驗：選用試劑盒配套的HBsAg陰陽性對照及第三方弱陽性質控品，使用 ELISA(A，B1，B2，B3 法)方法進行檢測，每個質控品連續重復測定20 次，計算變異系數（CV%）。

1.4 統計學分析 使用SPSS19.0 統計軟件對實驗結果進行統計學處理，多組間差異的比較采用卡方（χ2）檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各方法檢測HBsAg 精密度結果 見表2。根據說明書要求，陰性對照結果吸光度值＜0.10、陽性對照結果吸光度值＞0.80 時實驗結果有效，第三方弱陽性質控S/CO 值為2 ～5 有效。20 次質控實驗中，陰性對照結果吸光度均值0.008，陽性對照結果吸光度均值3.68，第三方弱陽性質控S/CO均值為3.98，實驗結果有效。A，B1，B2，B3 法批內重復性實驗（精密度）判斷標準為說明書要求的精密度變異系數（CV%）≤15%，均在要求以內。

表2 各方法對HBsAg 的精密度檢測（CV%)

2.2 各方法檢測HBsAg 定性結果 見表3。各方法與化學發光法（C 法）檢測結果進行比較，只有全自動酶免儀聯合酶標板快速孵育器孵育時間縮短1/2（B1 法）時的陰陽性檢測結果與化學發光法完全一致，全自動酶免儀單獨檢測（A法）時陰性結果一致，陽性結果有2 例不一致。但所有結果差異均無統計學意義（χ2=0～0.323，均P＞0.05）。

2.3 各方法檢測HBsAg 總樣本符合率、敏感度、特異度情況 見表4 。

表3 各方法檢測HBsAg 定性結果（n=200）

表4 各方法檢測HBsAg 總樣本符合率、敏感度、特異度情況(%)

3 討論

基于ELISA 具有成本低、簡便、靈敏等優點，因而ELISA 的臨床檢驗項目在各級醫院都得到廣泛開展。近年來，同一ELISA 檢測方法在不同檢測系統間的陽性符合率也越來越得到人們關注[4]。在ELISA 實驗中，孵育是檢測中影響檢測成敗的最關鍵因素之一[5]，因此，在確保檢測結果準確性的前提下，優化檢測流程和縮短檢測時間對臨床檢驗實際工作有重要的參考意義。

本研究以化學發光法作為檢測的金標準，本次實驗收集所有樣本的乙肝血清學模式均為HBsAg，HBeAg 和HBcAb 陽性或HBsAg，HBeAb 和HBcAb陽性。本次實驗采用全自動酶免分析儀聯合酶標板快速孵育器新流程。新流程在縮短1/2 時間的情況下，其檢測HBsAg 項目的敏感度比單純的全自動酶免分析儀敏感度更高。由此可見，新流程極大地縮短了檢驗項目的時長，減少了臨床醫生和患者的等待時間。當新流程將孵育時間縮短為原規定時間的1/3 和1/4 時，雖然和化學發光法檢測結果比較差異無統計學意義，但敏感度相對較低，有陽性漏檢的可能，所以不推薦將孵育時間縮短為原時間的1/3 和1/4。

本研究還發現，全自動酶免分析儀聯合酶標板快速孵育器檢測一些低滴度陽性標本中的敏感度高于全自動酶免分析儀，其原因可能為酶標板快速孵育器的升溫原理不一樣。酶標板快速孵育器的原理主要是通過發熱模塊產生空氣循環加熱，使用多個方向風扇旋轉使孵育腔內形成流動氣體，保證溫度的均勻性，且孵育全過程中結合振蕩，促進抗原抗體結合，能一定程度上增加試劑的靈敏度[6]。而全自動酶免儀孵育室只有微孔板金屬載架加溫，反應板孔受熱不均勻，孵育室整體空間比較大，升溫曲線較慢，溫度不準確，以及反應板周圍環境可達到預期溫度而孔內溫度不能達到預期溫度[7-8]。因此，在孵育過程中其實有大量的時間是用于升溫過程，而最佳孵育段的時間并沒有那么長。由此，金屬底板單面加熱可能是ELISA 自動化儀器的缺陷[9]。

研究中，HBsAg 含量越低，快速孵育縮短的時間越短，ELISA 漏檢率越高。本文結果與劉麗等[6]人的研究結果相比，縮短1/3 時間敏感度略有不同，可能與本文所選取的低值樣本較多和儀器試劑的敏感度不同有關。且本實驗除孵育環節不一致外，其它步驟均由同一儀器操作完成，減少了實驗的系統誤差和偶然誤差，使結果更具可比性。

通過本研究證實，優化后的全自動酶免分析儀聯合酶標板快速孵育器的方法檢測HBsAg，將孵育時間縮短至規定時間的1/2，在確保結果準確性的同時，縮短了整個檢驗項目的檢測時間，提高了工作效率，這對臨床標本的檢測具有重要的應用價值。