體外受精-胚胎移植（IVF-ET）胚胎培養液中HLA-G檢測在預測胚胎發育潛能和臨床結局中的應用價值研究

羅 平，沈開元，盧 娜，羅江霞，黃 芬，劉剛毅（柳州市人民醫院生殖醫學科，廣西柳州 545006）

關健詞：體外受精-胚胎移植；胚胎培養上清液；可溶性人類白細胞抗原G；發育潛能；臨床結局

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術的誕生為廣大不孕不育患者解決了生育難題，雖然該技術的臨床妊娠率已達到40%～60%，但因為追求妊娠率而導致的多胎妊娠已成為最常見的并發癥之一，其帶來的孕產期風險及后代安全隱患越來越明顯，因此選擇具有發育潛能的單胚胎移植以避免多胎妊娠已經成為趨勢。目前評價胚胎質量的主要方法是形態學評估法，但該方法具有一定的局限性[1]，不能很好地預測胚胎的發育潛能。人類白細胞抗原HAL-G（human leukocyte antigen G，HLA-G）基因在1987年被成功克隆，它是組織主要相容性抗原（major histocompatability complex, MHC）Ib 類 家族成員，與其他HLA I 基因具有同源的分子結構[2]，HLA 家族蛋白廣泛應用于癌癥以及一些遺傳疾病的診斷[3]，是一類敏感性較高的疾病標記物。HLA-G已被證實在未受精的卵母細胞及早期胚胎的二細胞至囊胚階段均有表達，其表達水平在每個發育階段的胚胎中都有著不同的變化[4]，在早期胚胎的培養液中也檢測到可溶性HLA-G 的存在并且證實其蛋白表達濃度可能與妊娠結局密切相關[5-6]。本研究通過檢測胚胎培養上清液中的HLA-G 含量，探討HLA-G 在評估早期胚胎質量、預測胚胎發育潛能中的應用價植，為臨床實施選擇性單胚胎移植提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2017年12月～2019年8月在我院生殖醫學科接受輔助生殖技術IVF-ET 治療的不孕不育夫婦共156 對，女方平均年齡34.25 歲，平均不孕年限3.56±1.89 歲，入組標準：女方年齡≤37 歲，基礎激素水平正常，排除標準：①子宮內膜異位癥或子宮畸形、腺肌癥；②輸卵管積水或宮腔積液；③盆腔黏連；④有家族遺傳病史；⑤夫婦染色體核型分析異常。

1.2 試劑和儀器 胚胎培養液購自瑞典Vitrolife 公司，胚胎冷凍液、解凍液購自日本KITAZATO 公司，HLA-G 檢測試劑盒購自捷克Exbio 公司，胚胎培養箱（型號：C200）購自德國Labotect 公司，酶標儀（型號：MK-3）購自美國ThermoFisher 公司。

1.3 方法

1.3.1 促排卵及取卵：嚴格按本中心超促排卵方案促排卵，當有2 個或以上卵泡直徑達到18mm 時注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）板機啟動，36h 后通過陰道B 超引導下穿刺取卵，所獲得卵冠丘復合物清洗干凈后置于受精培養液內繼續培養2～4h 后授精。

1.3.2 胚胎培養：授精后18～20h 將已拆除顆粒細胞的受精卵轉入卵裂培養基微滴（G1，Vitrolife，瑞典）置于6ml/dl CO2，5ml/dl O2，37℃培養箱繼續培養，標記正常受精卵。受精后第3 天（D3）對胚胎進行形態學（細胞發育速度、卵裂球數目、均一性及碎片率）評分，胚胎評分Ⅰ、Ⅱ級為優質胚胎，Ⅲ級以上為可用胚胎，Ⅳ級為不可用胚胎丟棄。本中心優質胚胎標準：卵裂球6～10 個，大小均一，碎片率≤20%，胞質均勻。根據患者情況選取評分最高的2 個優質胚胎移植或冷凍，剩余可用胚胎（Ⅲ級以上正常受精胚胎）繼續培養至第5 天（D5）觀察囊胚形成情況，采用單個培養法（每個液滴放一個胚胎）培養。用Gardner 評分系統[7]進行囊胚評分，D5 評分≥3BB 或D6 ≥4BB 視為優質囊胚，優質囊胚、可用囊胚移植或冷凍保存，不可用囊胚知情溝通后丟棄。

1.3.3 臨床結局：胚胎移植14 天后測尿HCG 或血β-HCG，移植后4 周B 超檢測孕囊及胎心搏動以確定是否臨床妊娠。

1.3.4 實驗室檢測：分別收集第3 天優質胚胎及第5 天囊胚移植或冷凍后其對應的培養上清液30～35ul,保存于0.5ml 的EP 管中，標記后-20℃冰箱保存。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測培養液中HLA-G 濃度，所有檢測步驟均嚴格按照說明書操作。

1.4 統計學分析 用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 驗驗；計數資料用率（%）表示，各組間率的比較采用卡方檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同妊娠結局患者基本情況和HLA-G 檢測結果比較 本研究共納入156 對助孕患者總計194 個新鮮胚胎（D3 胚胎和D5 囊胚）移植周期，根據妊娠結局分為臨床妊娠組和未妊娠組，兩組患者情況見表1。數據顯示兩組患者的平均年齡、不孕年限、抗苗勒氏管激素（AMH）、促性腺激素（Gn）天數、子宮內膜厚度、平均獲卵數、受精率、優質胚胎率差異均無統計學意義（P ＞0.05），妊娠組胚胎培養液中的HLA-G 表達水平顯著高于未妊娠組和生化妊娠組，差異均有統計學意義（P ＜0.01）。

表1 胚胎移植臨床結局各組間基本情況及HLA-G 濃度的比較

2.2 D3 胚胎繼續培養囊胚形成情況及HLA-G 在不同級別囊胚中的表達 根據D3 繼續培養胚胎級別分為 8 細胞優質胚胎組、其它優質胚胎組、8 細胞Ⅲ級胚胎組及其他可用胚胎組，比較各組囊胚形成情況，并分別檢測形成囊胚培養液中HLG-A 含量。結果顯示8 細胞優質胚胎組優質囊胚率、可用囊胚率及囊胚形成率顯著高于其他各組，差異有統計學意義（均P ＜0.05），形成優質囊胚、可用囊胚及不可用囊胚培養液的HLA-G 均值分別為12.36±5.27，8.15±3.69 和5.62±3.10 U/ml，，三組之間的差異有統計學意義（t=2.856， P ＜0.05）。

表2 D3 胚胎繼續培養形成囊胚情況的比較[%(n)]

2.3 HLA-G 濃度和胚胎移植臨床結局的比較 見表3。根據移植胚胎培養液HLA-G 濃度，按D3 卵裂期胚胎≥2.5U/ml 或D5 囊胚≥6.8U/ml 分為高濃度組和低濃度組，比較兩組胚胎移植后臨床結局。結果顯示HLA-G 高濃度組臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于低濃度組，差異有統計學意義(P＜0.01)，兩組之間的生化妊娠率和流產率比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。

表3 HLA-G 濃度與胚胎移植臨床結局的相關性比較[%(n)]

3 討論

自JURISICOVA A[4]等首次在培養液中檢出HLA-G 后，隨著研究的深入HLA-G 被認為對人類胚胎的發育和成功植入具有重要意義，多篇報道也指出sHLA-G 可以作為評價體外受精胚胎質量的指標并且能夠獲得更好的移植效果[8-10]。檢測培養上清液HLA-G 用來篩選更具發育潛能的優質胚胎進行移植，有利于降低多胎妊娠的風險并能獲得很好的臨床結局。HLA-G 對人類早期胚胎植入影響的機理為HLA-G 能夠阻止由母源毒性淋巴細胞引起的同種識別以及保護目標細胞免受自然殺傷細胞（natural killer cell, NK-cell）介導的溶解[11]，抑制子宮自然殺傷細胞的細胞毒作用和誘導細胞凋亡活化的CD8 細胞中表達的因子，從而保護胎兒滋養層細胞免受NK 細胞殺傷[12]。通過誘導細胞因子的釋放在胚胎與母體免疫耐受機制之間建立相應的“化學對話”以確保胎兒在母體內能安全發育[13-14]。

本研究結果顯示，胚胎移植臨床妊娠組培養液中HLA-G 濃度均值顯著高于未妊娠組和生化妊娠組，形成囊胚組培養液中HLA-G 的濃度高于非囊胚組，優質囊胚組高于非優質囊胚組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。證實HLA-G 蛋白特異表達于囊胚滋養層細胞內并促使其往胎盤發育，通過調控滋養層細胞的侵入能力并且促使子宮螺旋動脈血管的重塑為胚胎的成功著床和妊娠維持做好準備，其表達水平和臨床結局密切相關，可作為評價胚胎發育潛能的客觀指標，為挑選單個胚胎移植避免多胎妊娠提供依據。對于全胚冷凍或冷凍周期，選擇HLA-G 表達水平高的胚胎（囊胚）移植，中心的臨床妊娠率可由55%左右提高到69%，生化妊娠率和流產率降低至5%和3%。對于表達較高濃度HLA-G 的胚胎仍有31%左右未能成功妊娠，除與患者本身的機體狀態、子宮內膜容受性有關外，有研究[15]顯示培養至第3日的胚胎種植前遺傳學診斷（PGD）染色體顯示異常時其培養液中仍可檢測到HLA-G 表達，提示染色體的異常可能影響了這部分胚胎的植入。同時我們還觀察到對于第三天8 細胞Ⅲ級胚胎其囊胚形成率、HLA-G 水平與第三天非8 細胞優質胚胎相比差異并無統計學意義，顯示其亦具有較好的發育潛能，8 細胞優胚的囊胚形成率、HLA-G 含量與其他各組差異有統計學意義，提示我們在今后的胚胎形態學評分中應以胚胎的發育速度和卵裂球的均一性為主要評分依據。即往的文獻報道大多為檢測第三天胚胎上清液HLA-G 表達水平，本研究中168 枚可用囊胚培養上清液HLA-G 均值顯著高于第三天優質胚胎。證實HLA-G 隨著胚胎的不斷分化而升高，可作為胚胎發育潛能的獨立預測指標。

本研究的局限在于僅納入≤37 歲、卵巢功能正常患者且檢測例數有限，對于卵巢低反應或高齡尤其是≥40 歲患者，由于卵子的數量和質量下降，胚胎的發育潛能有限形成囊胚的幾率也隨之降低[16]，進行囊胚培養失敗的幾率升高而導致移植周期取消[17]，給患者造成較大的經濟和心理上的壓力，檢測D3 胚胎培養液HLA-G 水平也許更有利于選擇有發育潛能的胚胎移植。本研究結果真正應用于臨床還需要更多的數據和擴大檢測范圍來證實。同時由于ELISA 方法的局限性，培養液中雜質的干擾及檢測的特異度、敏感度都會影響到檢測值的真實性，而且檢測尚未具備上機自動化操作，因此對于移植前HLA-G 水平的檢測僅限于冷凍胚胎移植周期而不適用于新鮮胚胎移植周期。

綜上所述胚胎形態學評分結合HLA-G 值可較好預測胚胎發育潛能，改善臨床結局，為實施單胚胎移植策略提供客觀依據。相較于其他侵入性檢測方法而言，不僅能避免對胚胎的損害，同時也為評價早期胚胎的發育潛能提供客觀依據。雖然在檢測的時間點、檢測標準以及靈敏度上仍然存在不少的爭議，但不可否認利用HLA-G 作為生物學標記預測早期胚胎發育潛能仍具有巨大的應用前景。