COPD患者線粒體功能及代謝水平變化檢測與骨骼肌功能障礙的相關性研究

陳元菁，艾紅軍，王湘云，吳 瓊，常 雁，劉錦銘（上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院呼吸科，上海 200090）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種多因素參與、多機制介導的全身性慢性炎癥性疾病，具有明顯的肺外效應，其中骨骼肌功能障礙（skeletal muscle dysfunction，SMD）因其對預后的嚴重影響而愈發(fā)引起重視[1-2]。COPD 并發(fā)SMD 的機制尚不十分清楚，普遍認為與全身系統(tǒng)性炎癥、營養(yǎng)不良、運動量不足、缺氧、激素使用等所致患者肌肉損失有關，從而造成患者運動強度、耐力下降，甚至誘發(fā)COPD 急性發(fā)作[3-4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)線粒體作為機體代謝與活動所需能量及自由氧重要提供者，其功能變化可能與COPD 并發(fā)SMD 存在聯(lián)系[5]，但相關研究較少且缺乏足夠循證學依據(jù)。本研究通過檢測COPD患者外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PMBCs）線粒體功能、代謝水平變化，分析其與骨骼肌功能的相關性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018年12月～2019年12月楊浦區(qū)控江醫(yī)院呼吸內科門診就診的60 例COPD 患者的臨床資料。入組標準：①均符合中華醫(yī)學會發(fā)布的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》的診斷標準[6]；②年齡18～70 歲；③排除支氣管擴張、哮喘、肺癌等嚴重肺部疾病，或并發(fā)重要器官功能障礙者。其中男性37 例，女性33 例；年齡48～70（52.8±4.6）歲；COPD 病程2～15（9.3±2.5）年。根據(jù)患者是否并發(fā)SMD，分為COPD-SMD 組（n=21）和COPD 組（n=39）。另選擇本院同期健康體檢者30 例作為對照組，排除心腦肝腎等疾病。其中男性15 例，女性15 例；年齡45～70（51.6±4.3）歲。各組年齡、性別構成比等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究獲所有患者或家屬知情同意。

1.2 儀器與試劑 人外周血淋巴細胞分離液（Solarbio），TGL-16B 臺式離心機（上海安亭），QIAamp DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN），BriCyte E6 流式細胞儀（邁瑞）及JC-1（美國sigma）、熒光探針DCFH-DA（美國Thermo）試劑盒，科斯邁SMART 300 全自動化學發(fā)光測定儀，試劑盒由福州邁新生物技術開發(fā)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 線粒體功能檢測：抽取患者空腹外周靜脈血3 ml，肝素抗凝，按密度梯度離心法用淋巴細胞分離液分離出PBMCs，分裝后于-80℃保存。采用QIAamp DNA 提取試劑盒提取線粒體DNA（mitochondrial DNA, mtDNA），采用實時熒光定量RT-PCR 檢測mtDNA 拷貝數(shù)。采用流式細胞術檢測線粒體膜電位和細胞內活性氧（reactive oxide species，ROS），試劑盒分別為JC-1、熒光探針DCFH-DA。二者均以平均熒光強度（MFI）表示，激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為488nm，520 nm。

1.3.2 代謝指標檢測：取2ml 外周靜脈血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清胰島素樣生長因子-1( insulin-like growth factor-1，IGF-1)及瘦素(LP)水平，采用化學發(fā)光免疫法檢測空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，試劑盒均由福州邁新生物技術開發(fā)有限公司提供，所有操作嚴格按照說明書進行。

1.3.3 骨骼肌功能檢測：采用Nicolet Viking Quest型肌電誘發(fā)電位儀，陽極置于髕骨上緣與髂前上棘連線的中點，刺激電極沿肌肉纖維走形2 cm 處，刺激肌肉收縮后觀察股神經(jīng)傳導時間及動作電位幅度。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 軟件包對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組PBMCs 線粒體功能比較 見表1。與對照組比較，COPD 組、COPD-SMD 組PBMCs 中mtDNA 拷貝數(shù)、膜電位顯著下降，ROS 則顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。上述指標在COPD-SMD 組與COPD 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組PBMCs 線粒體功能比較(±s)

表1 各組PBMCs 線粒體功能比較(±s)

注：t1：COPD 組vs 對照組；t2：對照組vs COPD-SMD 組；t3：COPD 組vs COPD-SMD 組。

項目 對照組（n=30） COPD 組（n=39） COPD-SMD 組（n=21） t1 t2 t3 P mtDNA（copies） 2.38±0.23 2.07±0.37 1.36±0.49 4.03 10.26 9.97 ＜0.05 ROS 36.33±9.25 40.45±10.18 48.14±12.27 2.73 5.28 3.92 ＜0.05膜電位 2 386.88±651.90 1 980.67±505.47 1 352.63±306.61 2.92 9.24 6.75 ＜0.05

2.2 各組機體代謝水平比較 見表2。COPD-SMD組、COPD 組LP，F(xiàn)INS 顯著高于對照組，IGF-1較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。COPD-SMD 組LP，F(xiàn)INS 顯著高于COPD 組，IGF-1 較COPD 組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組機體代謝水平比較(±s)

表2 各組機體代謝水平比較(±s)

注：t1：COPD 組vs 對照組；t2：對照組vs COPD-SMD 組；t3：COPD 組vs COPD-SMD 組。

項目 對照組（n=30） COPD 組（n=39） COPD-SMD 組（n=21） t1 t2 t3 P LP(μg/L) 13.37±2.38 21.06±7.25 40.39±10.23 5.57 10.25 8.50 ＜0.05 IGF-1(μg/L) 45.33±9.15 38.45±8.26 16.14±4.18 3.27 14.26 11.57 ＜0.05 FINS(mIU/L) 12.83±3.93 18.34±4.57 24.93±6.34 5.27 8.01 6.64 ＜0.05

2.3 線粒體功能、代謝水平與股神經(jīng)功能相關性 見表3。Pearson 線性相關分析顯示，股神經(jīng)傳導時間與mtDNA、膜電位、LP 均呈顯著負相關，與ROS，IGF-1 呈顯著正相關性（P＜0.05）。股神經(jīng)動作電位幅度與mtDNA，膜電位、LP，F(xiàn)INS 均呈顯著正相關，與ROS，IGF-1呈顯著負相關（P＜0.05）。

表3 線粒體功能、代謝水平與股神經(jīng)功能相關性

3 討論

SMD作為COPD患者最重要的肺外表現(xiàn)之一，因其在發(fā)病早期缺乏典型癥狀易被忽略，隨著病情進展可出現(xiàn)肌肉體積減小、運動強度減弱、運動耐力下降，嚴重影響患者生存質量與預后[7]。最新指南強調，穩(wěn)定期COPD 患者的綜合評估中應納入SMD，代謝綜合征等并發(fā)癥的評估。目前，COPD患者并發(fā)SMD 尚無特殊有效治療方法，多局限于運動鍛煉、營養(yǎng)支持方面，但效果并不明顯。現(xiàn)研究已證實，氧化應激、細胞凋亡增加是導致肌肉丟失、萎縮進而誘發(fā)SMD 的主要機制之一，線粒體結構與功能障礙在COPD 并發(fā)SMD 中發(fā)揮著重要作用[8-9]。

線粒體作為骨骼肌運動所需能量的主要合成場所，可通過其通透性轉換孔調節(jié)細胞凋亡，且線粒體呼吸鏈在氧化磷酸化反應產(chǎn)生ATP 的同時產(chǎn)生大量ROS，可能導致DNA 損傷，進而引起呼吸鏈相關蛋白質合成障礙，形成缺陷呼吸鏈[10]。mtDNA是真核細胞除核DNA 外唯一的遺傳物質，每個線粒體中約有2～10 拷貝mtDNA，近年來在肺部疾病的診治及預后評估中的應用愈發(fā)廣泛，被視為線粒體功能的敏感指標。本研究中，COPD 患者PBMCs中mtDNA 拷貝數(shù)、膜電位顯著下降，ROS 則顯著升高（P＜0.05），而COPD 并發(fā)SMD 患者線粒體功能損傷更為突出，從而加劇對線粒體呼吸功能及細胞內氧化磷酸化過程的抑制，導致細胞產(chǎn)能持續(xù)下降[11]。KONOKHOVA 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，COPD 患者肌肉組織中DNA 氧化損傷產(chǎn)物羥脫氧鳥苷（8-OHdG）水平顯著高于健康人群，且mtDNA 分布密度下降，缺失率升高。戶元元等[13]報道稱，ROS 的大量釋放可通過影響肌質網(wǎng)功能、肌球蛋白ATP 酶功能及肌細胞線粒體呼吸功能等途徑引起肌組織萎縮、肌纖維類型轉換導致骨骼肌消耗增加。

骨骼肌是胰島素介導的葡萄糖攝取、代謝的重要靶器官，COPD 患者在長期反復炎癥、氧化應激狀態(tài)刺激下，下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統(tǒng)激活后促進糖皮質激素、兒茶酚胺等升血糖激素釋放，易導致骨骼肌出現(xiàn)胰島素抵抗（IR）[2]。研究認為，骨骼肌IR 與ROS 含量密切相關，生理水平ROS有助于維持骨骼肌強度，而過量ROS 通過損害線粒體功能、葡萄糖攝取導致骨骼肌IR[14]。本研究結果顯示，隨著SMD 的發(fā)生，COPD 患者血清LP，F(xiàn)INS 顯著升高，IGF-1 顯著降低（P＜0.05），與朱木林等[15]研究結果相似，表明COPD 并發(fā)SMD患者機體代謝水平升高，對脂肪合成抑制作用增強，能量消耗增加，促進骨骼肌蛋白質的分解。相關性分析發(fā)現(xiàn)，股神經(jīng)傳導時間及動作電位幅度與mtDNA，膜電位、LP 存在顯著相關性（P＜0.05），進一步證實了SMD 嚴重程度與線粒體功能、代謝水平密切相關。

綜上所述，COPD 患者存在線粒體功能減退，代謝水平異常，且與SMD 的發(fā)生密切相關，線粒體功能、代謝水平有望成為COPD 患者骨骼肌功能的評估指標。鑒于本研究樣本較少，且未對不同病情COPD 進行分層分析，所得結論尚需大樣本、更為完善的研究設計深入驗證。