腫瘤標志物檢測方法的研究進展

唐玉秀，閉雄杰

1廣西科技大學第二附屬醫院檢驗科，廣西 柳州545006

2廣西科技大學第一附屬醫院檢驗科，廣西 柳州5450060

腫瘤是指機體在各種致瘤因子作用下形成的新生物，涵蓋了不同的腫瘤種類，具有不同的病理類型、檢查和治療方法。腫瘤標志物指惡性腫瘤細胞分泌或脫落到體液或組織中的物質，可以反映腫瘤存在和生長情況，或被認為是宿主響應腫瘤而產生的腫瘤衍生產物[1]。腫瘤標志物檢測多數情況下具有高特異度和靈敏度，但不同的檢測方法會有明顯的差異[2]。目前腫瘤標志物的檢測方法仍存在較多難點，通過簡單易用的實驗室測試，可以檢測或驗證腫瘤的存在。臨床腫瘤標志物檢測具有無創、易于獲取標本、操作方便、易于動態監測疾病、成本低等優點[3]。對腫瘤的早期診斷、鑒別診斷、疾病監測、病理分型、指導治療和預后評估具有重要意義。臨床上，不同的腫瘤對腫瘤標志物的靈敏度和特異度不同，因此，檢測方法也有很大差異。本文對免疫學方法、液體活組織檢查和外泌體檢測三類常用的腫瘤標志物檢測方法進行綜述，為臨床腫瘤標志物檢測方法的選擇提供參考依據。

1 免疫學方法

腫瘤標志物主要包括蛋白質、激素、酶、多胺及基因產物等，集中分布在血液、體液、細胞或組織中，可以通過不同針對性的生化、免疫學及分子生物學等方法進行測定，對腫瘤的輔助診斷、鑒別、監測病情、療效及預后評估具有十分重要的臨床價值。

1.1 放射免疫測定（radioimmunoassay，RIA）

RIA是一種檢測腫瘤標志物的傳統方法，通過使用高靈敏度、準確度和未標記抗原的放射性同位素測量結合抗體特異性或競爭性抑制反應來定量體外微量物質的分析方法[4]。一般來講，涉及使用免疫學測定的技術可稱為RIA，只要涉及放射性同位素標記的抗原或抗體均可稱為RIA，包括競爭性RIA和非競爭性RIA。放射免疫分析使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易于標記和易于檢測衰變期間釋放的輻射的優點而被廣泛使用，并逐漸取代了3H和14C。RIA具有以下五方面優點[5-6]：①可以測量多種免疫活性物質；②高靈敏度，一般化學分析的檢出限為（10-9～10-15g）；③由于抗原-抗體免疫反應的特異性，特異度較高；④RIA應用廣泛，據不完全統計，已為RIA建立了至少300種生物活性物質，可以用于幾乎所有的激素、各種蛋白質、腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原、一些小分子（如環核苷酸）和藥物（如地高辛、毛地黃等）的分析，且范圍申請仍在擴大；⑤RIA是一種體外分析技術，試劑少、樣品用量少、反應時間短、操作簡單、對患者無輻射危害、易于自動化。但RIA也具有以下五方面不足[5-6]：①只能測量具有免疫活性的物質；②生物制劑的穩定性受多種因素的影響；③對某些含量極低的物質檢測靈敏度較低；④測量值是相對數量而不是絕對數量；⑤存在輻射和污染等問題。雖然RIA存在一些缺點，但隨著科學技術的進步，RIA作為一種定量分析方法將得到更廣泛和更深入的發展。

1.2 化學發光免疫測定（chemiluminescence immunoassay，CLIA）

CLIA是一種常用且相對成熟的腫瘤標志物檢測技術[7]。CLIA是一種將高靈敏度的化學發光測量技術和高特異性的免疫反應結合的檢測和分析技術。CLIA是繼RIA、無酶檢測、熒光免疫測定和時間分辨熒光免疫測定后的最新的免疫檢測技術。CLIA具有靈敏度高、檢測速度快、線性范圍寬、儀器結構簡單、適合小型化和無放射性危害的優點。CLIA采用發光物質（如吖啶酯）或酶催化劑[如辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）]直接標記抗體以標記抗原抗體[7]。CLIA與微芯片電泳分離及化學發光檢測技術相結合，具有檢測效率高、分析速度快、自動化程度高、樣品和試劑少的優點。Min等[8]研究觀察顯示，化學發光強度與鐵蛋白濃度在5.1～1300.0 ng/ml間呈線性關系，檢出下限為2.55 ng/ml。同時，CLIA的整個過程可以在45 min內完成，這種具有自動化和定量功能的芯片實驗室化學發光免疫測定平?臺為多種腫瘤患者即時檢測腫瘤標志物提供了一種有前途的策略。

傳統化學免疫測定系統中使用的天然酶具有穩定性差、來源有限、對環境變化敏感及易受環境影響而變性的缺點，且標記過程中通常可損害抗體分子的生物活性。近年來，無酶免疫系統的發展將電化學技術和化學發光結合來檢測腫瘤標志物，同時具有化學發光和電化學的優點。Yang等[9]研究結果顯示，一種新型的無CuS納米顆粒的CLIA被設計用于測定線性范圍為0.1～60.0 ng/ml且檢測下限為0.07 ng/ml的甲胎蛋白，該技術具有操作簡單、價廉、快速的特點，特異度高，且具有可接受的重復性和良好的準確性。

1.3 酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是在固相載體上吸附已知抗原或抗體，并在抗原-抗體復合物中加入酶標抗原或抗體用于抗原-抗體反應[10]。改變抗體的免疫學特性不會影響酶的生物活性，并且酶是由底物發展而來的，從而達到檢測目的。常用的ELISA方法是雙抗體夾心法（檢測大分子抗原）和間接法（確定特異性抗體）。用于標記抗體或抗體的酶必須具有高活性和高靈敏度、在室溫下穩定、反應產物易于觀察、可以商業化生產的特征[11-12]，包括HRP、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中HRP的使用最廣泛。不同的研究方案將選擇不同的ELISA策略，如使用單克隆、多克隆抗體和嵌合抗體來開發腫瘤標志物檢測試劑盒。ELISA開發后，其檢測系統也進行了不同程度的優化，如凝集素和生物素-抗生物素蛋白系統在ELISA中的應用極大地增強了其檢測的靈敏度[11]。此外，ELISA系統也不斷提高相關腫瘤標志物檢測的靈敏度。除ELISA外，更多具有酶活性的模擬酶的研究正在進行。Zhang等[13]使用夾心型比色法在可見光下改變3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine，TMB）的顏色，并通過TMB溶液水平的顏色變化量化癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。該方法在血清樣品分析中顯示出了良好的選擇性、重復性和穩定性。Aggarwal等[14]通過ELISA驗證了所選擇的生物標志物，即α-1抗胰凝乳蛋白酶（α-1-antichymotrypsin，ACT）、觸珠蛋白（haptoglobin，HAP）和視黃醇結合蛋白（retinol-binding protein，RBP），結果顯示，活動性腎病患者的ACT水平高于其他組患者，且與腎臟系統性紅斑狼瘡疾病活動指數（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）有很好的相關性；同時，該研究中活動性腎病患者的HAP水平高于其他組患者的10倍以上；治療后，ACT、HAP、RBP水平比治療6、12個月時降低；多元Logistic回歸分析結果顯示，ACT是區分活動性腎病和SLEDAI的最佳標志，尿液中的HAP、ACT和RBP是狼瘡腎炎活動的潛在生物標志物。

2 液體活組織檢查

液體活組織檢查，即液體活檢，是體外診斷的一個分支，指使用無創血液檢測技術來監測腫瘤或轉移瘤釋放到血液中的循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌體等，是用于檢測腫瘤和輔助治療的突破性技術[15]。既往臨床沒有對液體活檢給予足夠重視，且沒有發現其潛在的應用價值。隨著研究深入，CTC的潛在應用價值逐漸被人們發現，液體活檢的研究呈爆發性增長，現已逐漸應用于臨床。與組織活檢相比，液體活檢可以早期篩查和監測腫瘤標志物，具有無創、易取樣、操作簡便和實時監測等優點，但存在檢測費用較高且沒有統一的檢測標準等不足。Zhang等[16]的研究表明，CTC、ctDNA和外泌體檢測優勢明顯，作為一種非侵入性檢測方法，可以在治療前、治療期間和進展期間提供診斷和預后信息。Rolfo等[17]研究表明，液體活檢是非侵入性的檢測方式，應用前景廣闊，在臨床中可方便快捷的立即實施。Cohen等[18]對66例胰腺導管腺癌患者采用無創血漿液體活檢，探討多個腫瘤標志物聯合檢測是否優于任何單個標志物，結果發現，30%的患者存在鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）突變，血漿中發現的每個突變均與患者原發腫瘤中發現的突變相同（一致性100%）。聯合檢測KRAS與4個閾值蛋白質，即CEA、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）可將檢測靈敏度提高至64%。

2.1 CTC

在原發性乳腺癌、肝癌、結腸癌和前列腺癌等的形成和生長早期，腫瘤細胞從原發性腫瘤脫落，然后進入血流循環形成CTC。臨床可利用這些CTC不同的物理和生物學特性采用不同的技術來富集和檢測。CTC分析被認為是腫瘤患者的實時“液體活檢”。CTC的檢測和分子表征是腫瘤轉化研究中最活躍的領域之一，超過400項臨床研究將CTC作為生物標志物[11,19]。CTC主要采用免疫組化法，近年來，多種改進CTC檢測方法的創新技術逐漸應用于臨床，包括CTC微芯片、過濾裝置、定量逆轉錄PCR分析和自動顯微鏡系統。但分子特征研究表明，CTC有很強的異質性，這一發現強調需要多種方法來捕獲所有相關的CTC子集[19]。越來越多的證據表明，CTC能夠實時反映腫瘤進展，且這些信息在全身治療的背景下可能特別有用。預計CTC有助于在特定治療窗口內向特定的腫瘤患者群體指導特定的靶向治療，是個體化醫療的標志。Busetto等[20]為評估CTC對155例高危非肌肉浸潤性膀胱癌患者的預后評估價值，并評估兩種不同CTC分離方法的療效和可靠性，平均隨訪28個月的結果顯示，65例（41.9%）復發，27例（17.4%）疾病進展，9例（5.8%）淋巴結和（或）骨轉移，其他正常。在對CTC的分析中，Cell Search自動化系統（A組）陽性患者20例（19.8%），CELLection Dynabeads手動系統（B組）陽性患者24例（44.4%）；CTC陽性與首次復發時間密切相關，A組CTC陽性患者的復發率為75%，B組CTC陽性患者的復發率為83%；此外，疾病進展時間也與CTC密切相關。表明CTC可作為高危非肌肉浸潤性膀胱癌患者危險分層和預后的潛在標志物，以預測疾病復發和疾病進展。Arnoletti等[21]的研究結果顯示，壺腹周圍病變、壺腹腺癌和遠端膽管癌患者的CTC增殖能力較高，并對凋亡具有抵抗力，在接受術前化療的壺腹周圍病變、壺腹腺癌和遠端膽管癌患者中，壺腹周圍病變患者的CTC明顯增殖且對T細胞細胞毒性的抵抗力明顯降低。培養7天后，來自胰腺導管腺癌、遠端膽管癌和壺腹腺癌患者的CTC募集了多種免疫細胞類型，包括CD105+CD14+髓樣成纖維細胞，以組織成類球體簇。只有在壺腹腺癌和遠端膽管癌衍生的混合細胞反應培養物（mixed cell reaction cultures，MCR）中，簇形成才能促進CTC存活、生長和成纖維細胞分化。流式細胞儀消耗了CTC或髓樣成纖維細胞，消除了簇網絡的形成，而這些細胞群體的重新引入又重新構建了這種能力。該研究結果表明，胰腺導管腺癌、遠端膽管癌的CTC在門靜脈循環內的生存與多細胞類型簇內的免疫細胞的相互作用得到支持，這些簇可以作為局部復發和轉移性進展的載體。

2.2 ctDNA

對腫瘤組織進行基因分型以尋找可操作信息的體細胞遺傳改變已成為臨床腫瘤學的常規實踐。雖然這些序列改變具有很高的信息量，但腫瘤組織取樣具有明顯的內在局限性，這是因為腫瘤組織僅提供腫瘤異質性的快照，受到腫瘤異質性引起的選擇偏倚，并且可能難以獲得。經過細胞凋亡或壞死的細胞將DNA的無細胞片段釋放到血液中，且ctDNA的負荷與腫瘤分期和預后相關[22]。雖然ctDNA具有易降解、含量低等缺點，但DNA分析的靈敏度和準確度研究的最新進展，允許改變腫瘤中發現的體細胞基因組從而進行ctDNA基因分型。檢測和量化腫瘤突變的能力可有效地實時追蹤腫瘤動態，并用作液體活檢，應用于既往不可能的各種臨床和研究。

在腫瘤學中，檢測源自ctDNA具有三個主要原因，包括從正常ctDNA中區分ctDNA，存在有時極低水平的ctDNA，以及樣品中突變片段數量的準確定量[23]。通過突變來定義腫瘤DNA的存在有助于區分正常和腫瘤ctDNA。這些體細胞突變，通常是單堿基對的替換，僅存在于腫瘤細胞或癌前細胞的基因組中，且不存在于同一個正常體細胞的DNA中。這確保了ctDNA作為生物標志物的精細生物學特異性。因此，若腫瘤DNA片段在腫瘤患者的循環中豐富，則使用所有識別體細胞突變的DNA測序方法來鑒定ctDNA均較容易。不幸的是，檢測源自腫瘤的ctDNA存在很大的挑戰，主要是因為ctDNA通常僅占總ctDNA的1.0%。由于數字基因組技術允許在復雜的DNA混合物中計數罕見的突變體，因此，近期臨床對腫瘤患者ctDNA的研究逐漸增多。Schwaederlé等[24]為確定非小細胞肺腺癌患者血液ctDNA的基因組變化，對88例晚期肺腺癌患者進行了全面的血清ctDNA檢測，34例患者進行了下一代測序，25例沒有進行組織分子檢測，結果顯示，72例（82%）患者的ctDNA基因改變數量≥1，最常見的改變依次為TP53（44.3%）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）（27.3%）、MET（14.8%）、KRAS（13.6%）和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）（6.8%）基因。對于任何可檢測ctDNA改變的晚期肺腺癌患者，EGFR改變的一致性率為80.8%（ctDNA和組織測試之間100%vs61.5%，P=0.04）。25例患者（28.4%）接受了匹配≥1 ctDNA改變的治療，結果顯示，22例可評估患者中，72.3%（16/22）的患者實現了≥6個月的疾病穩定或部分緩解。隨后采用第三代EGFR抑制劑治療了5例經ctDNA檢測的EGFRT790M突變患者，所有患者均達到≥6個月的疾病穩定或部分緩解。變異等位基因數量≥1且變異等位基因分數≥5%患者的中位生存期明顯短于編譯等位基因分數＜5%的患者（P=0.012）。Riva等[25]調查了非轉移性三陰性乳腺癌患者ctDNA檢測對新輔助化療的評估價值，并在手術后檢測出最少的殘留腫瘤組織，結果發現，依據液滴數字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）制定的ctDNA檢測在基線時即可達到75%的檢測率。在新輔助化療期間，ctDNA水平迅速下降，且術后未發現最小的殘留病，但新輔助化療期間ctDNA水平的緩慢降低與較短的生存期密切相關。

2.3 外泌體檢測

外泌體是“生物活性囊泡”的最新家族成員，來源于多泡體與質膜的融合，以及管腔內囊泡的細胞外釋放，可促進細胞間通訊[16]。最近的研究多集中于外泌體的生物發生和組成，以及對外來體釋放的調節。研究已經證實，外泌體由造血和非造血來源的細胞釋放，但其功能仍不清楚。另一項研究表明，外泌體也可能促進感染因子的細胞間傳播[26]。此外，從感染了各種細胞內病原體（包括結核分枝桿菌和弓形蟲）的細胞中分離的外泌體，顯示含有微生物成分且可以促進抗原呈遞和巨噬細胞活化，表明外泌體可以在免疫監視中起作用[27]。Bach等[28]發現，原發性腫瘤微環境中，腫瘤組織分泌的外泌體和miRNA可以被其他細胞類型內化，這些外泌體中裝載的miRNA可能會轉移到受體利基細胞中，從而對基因表達進行全基因組調控。在腫瘤微環境下，外泌體miRNA如何促進耐藥性的發展尚未得到充分描述。Cheng等[29]研究表明，外泌體是通過穿梭貨物（如蛋白質、脂質、RNA、雙鏈DNA、非轉錄RNA和miRNA）轉運到腫瘤細胞、基質細胞和細胞外基質成分中轉移的介質，這種現象在腫瘤發生和耐藥性中均已表明。同時引入的外泌體提取的新方法，注重在卵巢癌外泌體的作為生物標志物和化療靶點的新興作用，并探討其潛在的臨床應用價值。

3 分子生物學方法

分子生物學是在分子水平上研究生物大分子的結構和功能，以解釋生命現象。分子生物學具有靈敏度高、特異性強、通量高等特點，但檢測周期長、成本高。分子生物學的主要研究領域是蛋白質系統，蛋白質-核酸系統/脂質系統（即生物膜）[30]。目前，用于檢測腫瘤標志物的分子生物學技術包括PCR、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）。

PCR是一種廣泛使用的體外擴增DNA技術，具有簡便、靈敏、高效、高特異度和快速性的特點。通過經典PCR開發的技術，如RT-PCR、擴增融合PCR和實時熒光定量PCR等通常用于檢測腫瘤，如肺癌、結腸直腸癌和乳腺癌[31]。此外，甲基化特異性PCR對DNA甲基化檢測的靈敏度較高。Lan等[32]研究發現，甲基化特異性PCR檢測胃癌標志物的檢出率明顯高于RT-PCR。FISH是將標記的探針與單鏈核酸片段配對，并在非放射性分子生物學和細胞遺傳學下使用原位雜交，通過熒光標記的取代同位素觀察靶序列的分布。盡管FISH是一種低通量測試，但它不需要放射性同位素標記，具有高探針穩定性、更經濟、更安全及良好的特異性，定位準確，出結果快速。FISH可以顯示不同的顏色，以便同時檢測多個序列，且檢測周期短。目前，FISH在腫瘤細胞、突變染色體和染色體重排中具有重要意義。

4 小結與展望

目前，傳統的腫瘤診斷方法包括病理活檢、B超、X線、計算機斷層掃描（CT）、內窺鏡檢查和磁共振成像（MRI），但腫瘤的早期診斷受上述診斷效果的限制。部分檢測方法難以應用于基層醫院，且由于昂貴的檢測費用增加了患者家庭的經濟負擔，因此，選擇一種有效的腫瘤早期診斷方法十分關鍵，腫瘤標志物的篩選已成為腫瘤早期診斷最有價值的指標。腫瘤標志物通常分布在尿液、血清、細胞、體液或組織中，常見的腫瘤標志物包括激素、碳水化合物抗原、酶標記物、癌胚蛋白和腫瘤抗原等。隨著醫學技術的發展，目前，已發現了大量的具有更高靈敏度或特異度的腫瘤標志物，且出現了不同的檢測方法，但每種標志物均有其自身的特征。如何整合不同的檢測方法，提高腫瘤標志物檢測的靈敏度、特異度和穩定性是研究人員一致探討的難點。因此，無論使用何種材料和方法，早期檢測低水平的腫瘤標志物，指導臨床治療是研究和開發所追求的最終目標。