circRNA 的生物學功能及其在卵巢癌中的研究進展

劉致新，孫文洲，李佳欣，于麗波#

哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院1婦科，2內科，哈爾濱 150000

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在人類基因組占相當大比例，在基因表達和調控中發揮著重要作用。除了核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉運 RNA（transfer RNA，tRNA）、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）、小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）等ncRNA外，環狀RNA（circular RNA，circRNA）也是ncRNA家族的成員。目前，circRNA已被發現存在于類病毒、酵母菌和人類基因轉錄本中，但對其認識尚不足，僅被認為是轉錄本中異常剪接的低豐度RNA。隨著高通量測序技術證實了circRNA在真核細胞中的普遍性及其與人類疾病發生發展的密切關系，circRNA已成為了RNA研究領域的熱點。

1 circRNA 的起源和特點

1.1 circRNA的起源

circRNA的末端不含有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，通過“反向剪接”以共價鍵的方式形成封閉的共價環狀結構，由編碼蛋白質基因、tRNA和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）之間的基因間隔物而產生[1-2]。circRNA根據序列來源的不同可分為3類：①外顯子circRNA，僅由外顯子組成，主要位于細胞質中；②內含子circRNA，僅由內含子組成，主要位于細胞核內；③外顯子-內含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA），由外顯子和內含子共同環化行成，主要位于細胞核內。

目前，circRNA主要由外顯子環化而成，外顯子的環化包括套索驅動環化和內含子配對驅動環化兩種形式[3]。在套索驅動的循環過程中，軸突跳躍產生一個套索，套索從內部被拼接后進而形成一個circRNA。套索驅動的另一種循環方式不是從軸突跳動開始的，而是由RNA的二級結構和含有軸突的Alus元件反向互補配對形成，環化軸突兩側的內含子連接供體剪接位點和受體剪接位點，形成最終的循環。近年來，研究顯示，堿基互補配對在內含子重復序列之間也同樣存在，軸突兩側內含子重復序列之間的互補配對在circRNA的形成過程中起重要作用，一個基因內的Alu反向重復序列（重組核酸內切酶的識別序列）之間的選擇性配對和競爭，可以產生多個circRNA。內含子的自環化也可產生內含子circRNA。

1.2 circRNA的特點

與線性RNA相比，circRNA具有以下特征：①主要分布于細胞質中，偶爾存在于細胞核中[4]；②通過順式作用元件介導的miRNA相互作用來調控靶基因的表達[5]；③主要由外顯子發展而來，偶爾由內含子或內含子片段發展而來；④主要調控內源性ncRNA的表達；⑤主要在轉錄前后起作用，偶爾在轉錄過程中起作用[6]；⑥具有組織特異性和發育階段特異性[7]；⑦常存在于唾液、血液、尿液等細胞外液中，其表達水平是線性mRNA的10倍[8]；⑧在各物種的進化過程中起保護作用；⑨具有共價閉合環狀結構，不含5'端帽子和3'端多聚（A）尾巴，對RNA外切酶或核酸外切酶RNaseR具有高度抗性[9]。這些特點使circRNA的生物學功能具有較高的穩定性。至今，在無細胞唾液（cell free saliva，CFS）中發現了400多株circRNA[10]。

1.3 circRNA 的生物學功能

1.3.1 作為微小RNA 的海綿 circRNA（主要是Sry-circRNA和CiRS-7）與微小RNA（microRNA，miRNA）之間的相互作用引起了研究者的廣泛關注。Capel等[11]發現，Sry是小鼠Y染色體上可以轉錄為circRNA的性別決定基因。有研究進一步驗證了Sry-cricRNA可以發揮miRNA的海綿作用，包含16個能夠結合miRNA-138的位點[12]。此外，CDR1as/CiRS-7是在人或小鼠腦中大量存在的circRNA，主要由小腦退化相關蛋白1（cerebellar degeneration-related protein 1，CDR1）反義鏈轉錄而成。CiRS-7中包括73個miRNA-7結合位點，并且具有吸附miRNA-7、上調miRNA-7表達和抑制miRNA-7生物學功能的作用。Thomas和S?trom[13]證明大量的circRNA可發揮海綿效應吸附miRNA。但是，目前，僅有小部分circRNA的海綿功能得到了驗證。

1.3.2 作為RNA 的結合蛋白 在細胞增殖、分化、轉位、凋亡、衰老、氧化應激反應過程中，RNA結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）主要參與RNA轉錄后的調控，包括選擇性剪接、轉運、翻譯。研究發現，當circRNA吸附Argonaute（AGO）蛋白、RNA聚合酶Ⅱ（polymeraseⅡ，PolⅡ）、真核生物起始因子4A-3（eukaryotic initiation factor 4A-3，EIF4A3）時，會產生穩定的RNA-蛋白復合物（RNA-protein complex，RPC）。RPC可以調節RBP的表達，并與線性RNA相互作用[14]。研究證明，部分circRNA與RNA具有協同作用，如與細胞周期蛋白結合的circ-foxo3和細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase2，CDK2）相互作用從而使細胞周期阻滯在G1/S期[15]。

1.3.3 作為編碼蛋白質的翻譯 circRNA屬于ncRNA，幾乎不編碼蛋白質。但是，一旦一個內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）被插入至circRNA起始密碼子的上游，編碼就會被啟動，并產生在功能上不同于線性RNA轉錄的轉錄本。真核核糖體的40S亞基可以與含有IRES的circRNA結合從而啟動翻譯。同樣，在大腸桿菌中，攜帶轉染綠色熒光蛋白開放編碼框的circRNA可以啟動綠色熒光蛋白的表達。但是，截止到目前，只有病毒中的circRNA被發現可以編碼真核細胞中的蛋白質，例如，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBⅤ）的衛星病毒丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDⅤ）可以通過與HBⅤ共轉染宿主細胞進行翻譯[16]。病毒中circRNA的翻譯可能與特定病毒介質有關。Legnini等[17]發現，攜帶IRES的circ-ZNF609可以翻譯肌蛋白。circRNA首次在RNA病毒中被發現[18]。Abe等[19]發現，在無任何特定因素允許進入內部核糖體的情況下，含有多個標記編碼序列的人工circRNA可以通過滾動圓擴增翻譯蛋白。

2 circRNA 在卵巢癌中的相關研究

卵巢癌是女性的常見惡性腫瘤，是婦科腫瘤相關死亡的重要病因，晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為30%[20]。卵巢癌患者通常采用腫瘤細胞減滅手術和鉑類標準方案進行治療。然而，常規治療往往會導致化療耐藥，從而導致腫瘤復發甚至死亡。因此，為了更好地控制卵巢癌的嚴重程度，有必要尋找新的分子機制和潛在的治療靶點。circRNA雖廣泛存在，但其表達豐度低，使其曾被誤解為剪接錯誤，而后高通量測序數據證實了circRNA在真核細胞中大量存在。值得注意的是，circRNA與人類多種疾病的發生機制密切相關，尤其是惡性腫瘤。然而，人們對circRNA在卵巢癌中的特性仍認識不足。

2.1 circRNA在卵巢癌中的表達

Ahmed等[21]對3例ⅢC期卵巢癌患者的原發灶、腹膜和淋巴結轉移灶進行RNA配對測序檢測，發現circRNA存在差異性表達，且mRNA的高表達與circRNA表達的下調是同步的。miRNA let-7負調控原癌基因RAS和MYC，在原發灶中的表達水平明顯低于腹膜轉移。但是，能夠編碼包含多個miRNA let-7結合位點的circRNA基因在原發灶中高表達，這可能是circRNA具有miRNA海綿作用的原因。Bachmayr-Heyda等[22]研究發現，circRNA豐度（circRNA指數）與卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞的增殖具有相關性。

2.2 circRNA對卵巢癌細胞生物學行為的影響

Xie等[23]等研究發現，circEPSTI1在卵巢癌組織中過表達，且抑制circEPSTI1的表達能夠抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲，加速腫瘤細胞凋亡；circEPSTI1序列中存在miRNA-942的互補位點，且miRNA-942在卵巢癌組織中呈低表達；熒光素酶檢測結果發現circEPSTI1能與miRNA-942直接結合；MS2bp-MS2bs的RNA免疫沉淀實驗結果發現，miRNA-942主要富集于MS2bs-circEPSTI1結合物中，表明circEPSTI1與miRNA-942存在一定的相互作用；通過熒光素酶實驗發現EPSTI1在卵巢癌組織中呈過表達，同時miRNA-942可抑制EPSTI1的表達，表明EPSTI1是miRNA-942的直接靶點。因此，敲除circEPSTI1后EPSTI1的表達下降，但miRNA-942可以逆轉此種抑制作用。這些結果表明，circEPSTI1可以通過海綿miRNA-942調控EPSTI1的表達和卵巢癌的進展。

Luo等[24]研究發現Circ-ITCH在EOC組織中的表達水平低于鄰近組織，且與EOC的腫瘤大小和FIGO分期呈負相關；Circ-ITCH高表達對EOC細胞的增殖起抑制作用，對腫瘤細胞的凋亡起促進作用。Circ-ITCH位于染色體20q11.22上，主要通過加強E3泛素連接酶的作用，促進磷酸化Dvl2的泛素化和降解，進一步對Wnt信號發揮抑制作用，從而在乳腺癌、食管癌、肝癌等多種腫瘤的發生中起抑制作用，已被證明可以介導多個基因或信號通路，在細胞的增殖、分化、凋亡和侵襲中發揮重要作用[25-28]。由此可推測，circRNA的表達水平與OC細胞的增殖、侵襲及轉移等多種惡性生物學行為有關。

2.3 circRNA作為卵巢癌生物標志物

circRNA表達的差異性是其作為生物標記物的基礎，在多種腫瘤的進展、治療與預后預測中發揮不同的作用。Li等[29]研究表明，circ-CSPP1在卵巢癌組織中的表達水平高于正常卵巢組織和良性卵巢病變組織，且circ-CSPP1的表達與卵巢癌的腫瘤分期、分化程度呈正相關；研究還發現，沉默circ-CSPP1可上調miRNA-1236-3p的表達。有研究發現，miRNA-1236-3p通過與E盒結合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）靶向結合從而在卵巢癌中發揮抑癌作用，沉默circ-CSPP1可下調ZEB1蛋白及其mRNA的表達[30-31]。ZEB1主要通過誘導腫瘤細胞發生上皮細胞-間充質轉化從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。因此，在卵巢癌細胞系中沉默circ-CSPP1可以上調miRNA-1236-3p的表達，降低ZEB1mRNA和蛋白的表達水平，進而抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲，結果提示，circ-CSPP1的表達越活躍，腫瘤的惡性程度越高，預示卵巢癌患者的預后較差。

2.4 circRNA 作為卵巢癌治療新靶點及預后判斷新指標

Hu等[32]研究發現，circ-ITCH、miRNA-145在卵巢癌組織和細胞中的表達呈負性相關。circ-ITCH在體內外通過circ-ITCH-miRNA-145-RASA1軸發揮外顯子circRNA海綿作用，進而提高RASA1的表達水平、抑制惡性腫瘤的進展，為卵巢癌提供了新的治療靶點。關于circ-ITCH對預測腫瘤預后的價值，也進行了多項研究。因此，circ-ITCH高表達可能是EOC患者OS的獨立預測因子。

Bao等[33]采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術檢測了 ⅤPS13C-has-circ-001567、RAD50-has-circ-00718、SPECC1-has-circ-000013在卵巢癌組織及癌旁組織中的表達情況，為circRNA參與卵巢癌的發生、發展提供了新的證據，研究結果顯示，三者在卵巢癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，其中，ⅤPS13C-has-circ-001567在卵巢癌組織中的表達水平明顯升高，推測ⅤPS13C-hascirc-001567在EOC發揮重要作用；實驗結果顯示，腫瘤分期和淋巴結轉移與高表達的ⅤPS13C-hascirc-001567呈正相關。該研究還發現，ⅤPS13C-has-circ-001567參與了卵巢癌細胞的上皮-間充質轉化過程，且通過敲低VPS13C-has-circ-001567的表達導致細胞周期G1期阻滯和細胞凋亡，進而抑制了細胞的增殖和侵襲。因此，在臨床治療中可通過抑制腫瘤細胞中VPS13C-has-circ-001567基因的表達，進而抑制腫瘤的發生、發展。基于此，推測靶向circRNA（VPS13C-has-circ-001567）可能是卵巢癌患者預后預測和克服治療相關耐藥性的新靶點。

Ning等[34]研究發現，與正常卵巢組織相比，部分circRNA在EOC中存在差異性表達，在EOC的發展中可能發揮重要作用；circEXOC6B和circN4BP2L2的表達水平分別與EOC患者的OS、無進展生存期呈正相關，與國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期、淋巴結轉移呈負相關。circEXOC6B和circN4BP2L2可能具有作為EOC預后標志物的潛力，從而輔助EOC患者選擇個性化的治療方案。

作為ncRNA家族的新成員，circRNA似乎更具有成為新的生物標志物及治療靶點的潛力。由于高成本的高通量測序和較少現有研究測序的樣本量，雖然后續驗證總樣本量滿足統計學要求，但具體到卵巢癌各組織分型樣本數據明顯欠缺，從而使circRNA在各組織分型中橫向對比的數據缺失或不可靠。但circRNA結構穩定、較長半衰期且不易被降解的特征為針對circRNA藥物的進一步研發賦予可行性。目前，基于circRNA的藥物研發尚處于起步階段，其相關功能和機制尚不明確，有待進一步研究。

3 小結與展望

目前，對circRNA的研究尚處于起步階段，尤其在卵巢癌研究領域甚少。由于人們對circRNA認知的缺乏，導致circRNA曾一度被認為是RNA剪接過程中的“噪音”。隨著高通量測序和生物信息技術的發展，circRNA的生物學特點、生理功能及其在相關疾病中的作用被發掘，進而成為了RNA領域新的研究熱點。circRNA有望成為一種新的卵巢癌的生物標志物，為其臨床診斷、治療及預測預后提供新的思路。