微小RNA-20和線粒體融合蛋白1在子宮內膜癌中的表達情況及臨床意義

王曉健，鐘建明，劉小丹，曾慶芳

贛州市腫瘤醫院門診部，江西 贛州 341000

子宮內膜癌的發病率居中國女性生殖系統惡性腫瘤的第2位，嚴重威脅女性的生命健康[1]。目前子宮內膜癌的臨床治療效果并不理想，主要原因在于多數患者確診時已處于中晚期，腫瘤細胞已發生轉移。因此，臨床上迫切需要尋找子宮內膜癌標志物，以便進行早期診斷和預后預測。研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）-20在肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中均存在異常表達[2]。線粒體融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）是一種腫瘤相關蛋白，通過生物信息學軟件預測發現，MFN1可能是miRNA-20的靶基因，因此推測miRNA-20可能通過影響MFN1基因表達，調控子宮內膜癌細胞增殖、凋亡、侵襲及轉移等生物學行為，但具體的作用機制還有待進一步分析[3]。本研究檢測了子宮內膜癌組織中miRNA-20和MFN1的表達水平，并探討了miRNA-20和MFN1表達情況與子宮內膜癌患者臨床特征的關系，旨在為子宮內膜癌的早期診斷、高危人群篩選及治療新靶點的尋找提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2019年1月于贛州市腫瘤醫院接受手術治療的子宮內膜癌患者。納入標準：①經病理學檢查確診為子宮內膜癌；②接受手術治療，且術前未行放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤。依據納入和排除標準，本研究共納入66例子宮內膜癌患者。同時選取60例接受子宮全切術的子宮肌瘤患者作為對照。子宮內膜癌患者的平均年齡為（52.10±8.29）歲；平均體重指數為（22.10±2.10）kg/m2；絕經37例，未絕經29例。子宮肌瘤患者的平均年齡為（50.38±9.11）歲；平均體重指數為（22.40±1.92）kg/m2；絕經35例，未絕經25例。子宮內膜癌患者和子宮肌瘤患者的年齡、體重指數、絕經情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。收集子宮內膜癌患者的子宮內膜癌組織66例和子宮肌瘤患者的正常子宮內膜組織60例。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miRNA-20的相對表達量

取子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織標本進行研磨，加入1 ml Trizol試劑后經氯仿抽提，加入異丙醇沉淀后獲得總RNA。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）兩步法將RNA逆轉錄為cDNA，然后進行擴增。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸20 s，循環40次。miRNA-20上游引物為5'-CAAATGCTCATAGTGCAGGTAG-3'，下游引物在逆轉錄試劑盒中；以β-actin為內參，上游引物為5'-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3'，下游引物為 5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。采用 2-△△Ct法計算 miRNA-20 的相對表達量[4]。

1.3 免疫組織化學染色法檢測MFN1的表達情況

石蠟切片經梯度乙醇脫蠟及水化，蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2次，每次3 min，然后進行抗原修復。為降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，采用H2O2室溫孵育10 min，然后PBS沖洗3次。滴加適當比例稀釋的羊抗兔MFN1抗體（1∶1000），37℃溫箱中孵育30 min，4℃孵育過夜；滴加堿性磷酸酶標記的二抗后，37℃溫箱中孵育30 min，PBS沖洗3次；1 ml二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）混勻后滴加到切片上，孵育10 min后顯色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察[5]。

1.4 隨訪發法

所有患者均采用門診和電話等方式進行隨訪。術后2年內，每3個月隨訪1次，術后2～7年，每6個月隨訪1次，隨訪截止時間為2020年6月。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜癌組織和正常子宮內膜組織中miRNA-20和MFN1表達情況的比較

子宮內膜癌組織中miRNA-20的相對表達量為（0.65±0.12），明顯低于正常子宮內膜組織的（1.03±0.17），差異有統計學意義（t=-14.597，P＜0.01）。子宮內膜癌組織中MFN1的陽性表達率為48.48%（32/66），明顯低于正常子宮內膜組織的80.00%（48/60），差異有統計學意義（χ2=13.467，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中miRNA-20相對表達量的比較

不同年齡、體重指數、絕經情況、病理類型的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中miRNA-20的相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中miRNA-20的相對表達量分別明顯低于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表1）

2.3 不同臨床特征子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中MFN1陽性表達率的比較

不同年齡、體重指數、絕經情況、病理類型的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中MFN1的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中MFN1的陽性表達率分別明顯低于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表1 不同臨床特征子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中miRNA-20相對表達量的比較（n=66）

表2 不同臨床特征子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中MFN1陽性表達情況的比較（n=66）

2.4 預后因素分析

截至2020年6月，66例子宮內膜癌患者的生存率為81.82%（54/66），中位生存期為77個月。以子宮內膜癌患者的FIGO分期、淋巴結轉移情況、miRNA-20相對表達量和MFN1表達情況作為自變量，以患者預后作為因變量進行Cox比例風險回歸分析，結果顯示，FIGO分期、淋巴結轉移、miRNA-20相對表達量和MFN1表達情況均是子宮內膜癌患者預后的影響因素（P＜0.01）。（表3）

3 討論

子宮內膜癌是發病率僅次于宮頸癌的婦科惡性腫瘤，近年來子宮內膜癌的發病率呈逐年上升且年輕化趨勢。雖然子宮內膜癌的治療技術與方法不斷發展，但對于中晚期子宮內膜癌的治療效果仍欠佳，特別是晚期和復發的子宮內膜癌患者，其治療效果不理想[6-8]。因此，進一步探索子宮內膜癌中具有特異性和敏感性的分子標志物和治療靶點是對子宮內膜癌進行早期診斷、改善治療效果的關鍵。

miRNA可通過與靶基因3'端的完全或不完全互補結合而抑制目的基因的翻譯及表達。相關研究已證實，miRNA在不同類型腫瘤中均可呈異常表達并參與個體發育、細胞分化、增殖、代謝、凋亡、遷移和侵襲等細胞生物學過程[9-11]。線粒體分解蛋白與線粒體融合蛋白的相對平衡是保證線粒體功能正常的基礎，而線粒體功能可決定多種信號轉導通路發揮作用。早期胚胎發育及卵母細胞成熟分裂的過程中，MFN1蛋白表達顯著增加，囊胚期MFN1蛋白的表達量處于最高峰，進而參與卵母細胞的成熟分裂和組織的發育過程，這也提示MFN1與細胞的增殖、分裂具有密切聯系[12-15]。

本研究結果顯示，子宮內膜癌組織中miRNA-20的相對表達量和MFN1的陽性表達率均明顯低于正常子宮內膜組織。超過半數的miRNA定位于或靠近染色體腫瘤區域，這些區域多存在基因缺失或異常擴增，能夠調控多種重要的癌基因或抑癌基因，因此miRNA-20表達量下降可能影響相關信號通路，進而促進腫瘤的發生發展。MFN1蛋白表達水平的升高可增強線粒體融合功能，進而通過降低蛋白磷酸化水平和抑制胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2活化或周期蛋白的表達，從而抑制細胞生長，因此子宮內膜癌組織中MFN1蛋白表達水平下降可提示細胞異常生長，細胞異常增殖誘發癌變。

本研究結果還顯示，FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者子宮內膜癌組織中miRNA-20的相對表達量和MFN1的陽性表達率分別明顯低于FIGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。該結果提示子宮內膜癌組織中miRNA-20及MFN1的表達水平越低，子宮內膜癌的發展越快。miRNA-20主要包裹在微小體、凋亡小體及其他外泌體中，能夠在化學修飾作用下與血漿小分子物質形成蛋白復合體及囊泡，進入機體并被轉運至受體細胞，再通過內吞、融合及結合受體等方式影響腫瘤的發生、發展。子宮內膜癌細胞生長需要線粒體不斷裂變、聚變，生長過程需要消耗較多能量，而MFN2介導線粒體融合過程中重要蛋白質及內質網的應激反應，MFN1作為MFN2的替補蛋白，MFN2高表達時，MFN1低表達。

表3 子宮內膜癌患者預后影響因素的Cox比例風險回歸分析（n=66）

本研究的多因素分析結果顯示，FIGO分期、淋巴結轉移、miRNA-20相對表達量和MFN1表達情況均是子宮內膜癌患者預后的影響因素（P＜0.01）。研究證實，miRNA-20能夠調控抑癌基因的表達，從而影響細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、β-聯蛋白（β-catenin）等細胞凋亡蛋白的表達，進而抑制細胞凋亡[16-18]。因此，miRNA-20可能通過影響細胞的正常凋亡影響子宮內膜癌的發生發展。MFN1具有細胞周期阻滯作用，可抑制細胞增殖和集落形成，削弱腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。因此MFN1低表達時，子宮內膜癌細胞異常增殖，從而促進了腫瘤的發生、發展。

綜上所述，miRNA-20和MFN1在子宮內膜癌組織中呈低表達，且其表達情況與患者的臨床特征和預后具有一定的關系。miRNA-20和MFN1有望成為子宮內膜癌早期診斷、惡性程度及轉移潛能的重要預測指標，并有可能成為潛在的治療靶點，具有廣闊的臨床應用前景，值得進一步研究。