胃癌干細胞標志物的研究進展

代俊澤 金海峰 (延邊大學 醫學院，吉林 延吉 3300；附屬醫院內科教研室)

胃癌(GC)在全部惡性腫瘤中的致死率常年居高不下(排名前3)。早期GC的發生發展通常沒有明顯病癥，這就造成了許多患者發現時已經處于晚期，無法進行治療或治療無效。有調查顯示，在2018年GC新病例超過1 000 000例，并估計有783 000例患者死亡〔1〕。隨著近代醫學的日益更新，對腫瘤本質的掌握也更加透徹，于是出現了癌癥干細胞(CSC)理論。近年愈來愈多的實驗也表明，胃干細胞的定位與GC發生地點相互吻合，意味著可以從干細胞疾病的治療方向入手來治療GC。目前，GC的治療仍以傳統的放射線療法和化學療法為主，但此方案的短板是不能完全消除CSC。因此，探索穩定性高、特異性強并檢測難度小的GC干細胞(GCSC)標志物，或許能為消滅癌癥、根治GC提供一種全新的方案。此文針對現階段研究較多或較成熟的GCSC標志物作一綜述，提出較新穎、潛力大的治療方案。

1 CSC

大多數腫瘤是由一個細胞亞群結合而來，這個亞群最大的特點就是具有干細胞特性，稱為CSC。CSC對整個腫瘤的生命起關鍵作用，采用自我無限增殖方式來影響腫瘤的啟動、發展及治療后復發概率。CSC的起源包括以下幾種：①惡性腫瘤的實質細胞；②協助或誘發腫瘤擴散的細胞；③因耐藥性而誘發或復發的因素〔2〕。相關研究數據〔3，4〕也表明，CSC可誘導腫瘤的發生，并在隨后的轉移、治療(放療或化療)中起決定性作用。綜上可見，CSC是腫瘤增殖引發劑之一，現階段普遍認同通過此靶點治療效果優于傳統治療方案。

2 GCSC標志物

現階段GCSC標志物主要包括造血干細胞抗原(CD133)等(表1)。其中主要參與癌癥發生、發展的有CD133、富含亮氨酸重復序列的G蛋白耦聯受體(Lgr)5、上皮細胞黏附因子(EpCAM)等；CD44、miRNA、性別決定區Y框蛋白(SOX)2對胃癌的轉移及侵襲影響較大；作用于癌癥預后主要有CD44、三磷酸腺苷酶結合盒轉運蛋白G亞家族成員(ABCG)2等；CD24、乙醛脫氫酶(ALDH)1等可增強癌癥組織對藥物的耐藥性。以上通?？捎糜阼b別和分離GCSC。

表1 GCSC相關生物學標記物

2.1CD133 CD133約120 kD，是一種單拷貝基因產物，主要局限于腫瘤組織表達，在癌后病變的階段沿黏膜內癌和結締組織之間的邊界表達〔5〕。它被普遍發現于多種惡性腫瘤的，鑒于此并在相關實驗中加以使用〔6～8〕。以GC為例，陸瑞祺等〔9〕的研究發現，在原發性GC的黏膜和黏膜下層細胞膜上均可見CD133的表達，并且表達程度相較于癌旁正常胃組織顯著上移(P<0.05)。并且CD133+子集細胞可以在人類GC中分離、純化和擴增。此外，也具有如提高體內的致瘤能力等。因此，可以表達一些干細胞標記。

此外，CD133還是良好的預后標志〔10〕。Chen等〔11〕實驗顯示，高水平的CD133患者的預后較低水平患者明顯降低(P<0.001)，由此說明，CD133可成為獨立預后因素，Liu等〔12〕實驗表明，CD133+可以預測GC患者的存在或即將出現的臨床病理特征和較差的生存率。此外，CD133也可能在GC的病理生理，整合和補充中起關鍵作用。

5-氟尿嘧啶(Fu)化療是GC晚期的一種首選治療方案，但其有效性受到耐藥性的限制。同時也存在實驗〔13，14〕表明，CD133可以通過調節GC細胞中磷酸肌醇3-激酶/Akt/p70S6K途徑介導的P-gp和Bcl-2家族的表達來抑制5-Fu誘導的凋亡。Xu等〔15〕實驗發現，經5-Fu的化療后，剩余的GC組織中B淋巴瘤Mo-MLV插入區(BMI)1(參與CSC維持的關鍵分子)的表達增加了。并且，基于5-Fu的新輔助治療后接受手術的GC患者BMI1表達與無病生存之間存在直接關系。由此，提示BMI1也是一種潛在的應用價值較大的靶向治療方向。

以上研究均證明CD133可作為GC鑒別、診斷及預后的重要生物指標，并對GC患者開發新的治療方案起到一定的作用，但涉及的具體調節機制仍需進一步探究。

2.2CD44 CD44基因高度保守，相對分子質量為85～200 kD，位于第11號染色體上。CD44家族包括普遍表達的標準CD44(CD44s)和在角質形成細胞(CD44v3-v10)，上皮細胞(CD44v8-v10)及活化的淋巴細胞和巨噬細胞(CD44v6)中具有特定分布的CD44剪接變體(CD44v)。

Mayer等〔16〕最先發現，CD44的表達在GC患者中預示著癌癥發展惡劣。這一點在后來相關研究〔17，18〕中也得到了證實。此外，大量實驗〔19～21〕進一步觀察到CD44及CD44v6具有正向調節淋巴結轉移和遠處轉移的意義，且與GC患者預后較差有關。這顯示CD44和CD44v6可能均是GC患者有效的鑒別或預后的生物標志物。AT-hook2(HMGA2)是一種高遷移率的轉錄調節劑，可在CSC中介導運動性和自我更新。Sun等〔22〕實驗發現，HMGA2可通過調節CD44的表達來促進GCSC誘導和細胞運動。因此，在GC中靶向HMGA2可對治療提供了新的方向。

目前，隨著生物材料工程學的進步，允許在水凝膠中設計模仿重要腫瘤樣特征的三維(3D)培養物，從而揭開傳統2D塑料表面無法觀察到的癌細胞行為。在3D培養物中，GC細胞失去了標準CD44同種型(CD44s)的表達，而獲得了CD44變體6(CD44v6)的表達。并且這種剪接開關是可逆的，由于營養缺乏而加速，并在較低的初始細胞密度下延遲，提示環境脅迫誘導的應答。進一步顯示它依賴于水凝膠基質的機械性能，并伴隨著上皮-間質轉化(EMT)，代謝和血管生成的基因上調〔23〕。這項研究提供了一種新的模型系統來研究CD44功能障礙，其在癌癥中的作用已受到關注數十年。

2.3CD24 CD24又命名為熱穩定抗原(HSA)，為一種細胞黏附分子存在或表達于許多B淋巴細胞和分化神經母細胞表面。CD24在不同種腫瘤中的表達也不盡相同，如宮頸癌中表達程度顯著大于乳腺癌。

Wang等〔24〕和Zhao等〔25〕實驗發現，CD24可促進細胞侵襲并調節GC細胞中E-鈣黏蛋白，纖連蛋白和維生素D受體的表達進而促進GC發生并促進侵襲來誘導GC發展。同時，Jiao等〔26〕研究也發現，CD24參與人GC細胞系AGS的增殖，侵襲和化學敏感性，而CD24蛋白表達的下調降低了GC細胞的轉移潛能并增加了化學敏感性。Xu等〔15〕的研究證明，5-FU耐藥的人GCSC樣細胞的 CD133和CD44高表達及CD24低表達參與GC的發生發展及治療后復發。以上研究均證明CD24 高表達可作為GC細胞中的CSC標志，同時表達水平的高低也可被認為是獨立的預后因素。此外，在Jia等〔27〕實驗發現，CD24基因中的P-534位點影響了GC總體生存，提示可從此位點入手，為臨床胃癌的診斷、預后等提供了新思路。

2.4Lgr5 Lgr5是Wnt通路的靶基因?？捎糜跇擞浳干掀ぷ婕毎?。Lgr5在胃CSCs的維持中具有至關重要的作用〔28，29〕，有可能是GC潛在治療靶點。Simon等〔30〕和Liu等〔31〕實驗發現，Lgr5高表達與總生存率低顯著相關，且Lgr5+GC患者的中位生存期(28.0±8.6)個月比Lgr5-患者(54.5±6.3)個月短，提示高Lgr5與GC患者預后不良有關。大量研究〔32～34〕表明，形成腫瘤球的標本中GC細胞表達高Lgr5。Lgr5陽性GC細胞的選擇性耗竭導致GC細胞的生長明顯被抑制，提示Lgr5非常有希望成為GC潛在干細胞標志物。此外，相關研究〔35～37〕發現，高表達的Lgr5與腫瘤的TNM階段、大小、浸潤深度等并無聯系，與患者年齡與GC類型存在很大的關系。Lgr5可能參與了GC發生過程中的腸上程度皮化生。這種病理分型的差異，對制定GC恰當治療方案具有現實意義。

同時，Lgr5的表達具有空間性和時間性〔30〕。在非腫瘤性胃黏膜中，LGR5+細胞主要定位在黏液頸部。在腸上皮化生中，LGR5+細胞主要定位隱窩底部，但在GC中，LGR5陽性細胞定位于腫瘤中央區域和管腔表面部位。LGR5在GC的腫瘤中心表達與腫瘤的局部生長(T類)和淋巴結擴散(N類)顯著相關，這也為GC的靶向治療方法提供了新思考方向。

2.5EpCAM EpCAM由GA-733-2基因編碼，其胞內區域有26個氨基酸殘基，胞外區域有265個氨基酸殘基組成的兩個生長因子樣結構，分子量為40 kD。

Warneke等〔38〕實驗發現，EpCAM信號通路中的所有成員均在GC中表達。并且，該表達彼此之間以及與各種臨床病理患者特征(包括患者的存活)顯著相關。由此說明，EpCAM信號通路是GC中比較理想的治療靶標。其他相關實驗〔39～42〕也表明，GC組織中的EpCAM表達上調，并與GC的大小及擴散呈現一定聯系，可能預示預后較差。這意味著EpCAM可能作為一種新的預后因素。Chen等〔43〕調查進一步證實，EpCAM與腫瘤的進一步惡化發展相關，低表達更有利于患者的預后。因此，它可作為獨立的預后因素。以上均說明 EpCAM可作為 CSC 標志物在預后方面的價值，對GC具有重要意義。

2.6ABCG2 ABCG2被稱為與人類腫瘤中多藥耐藥性相關的關鍵調節劑，能夠拮抗部分化療藥物的抗腫瘤作用〔44，45〕。它屬于ABC轉運蛋白家族的一位成員。

在Wang等〔46〕調查中，通過對NCBI GEO數據庫中19 826個樣本進行分析，觀察到ABCG2經常在GCCG中異常表達，并與GC的臨床病理特征和不良的預后有關。同時還發現關鍵的GC啟動子CRKL與ABCG2呈顯著正相關，很可能是上游CRKL的靶標，提示可以從此方向進一步研究其用于GC診斷和治療。研究表明〔47〕，ABCG2 表達異常增高，這也就意味著腫瘤患者術后復發概率很大，并且在治療后整個也會遇到許多問題。

SP細胞是腫瘤起始細胞的一個細胞亞群。ABCG2賦予了SP細胞的大部分形態，即CSC。通過Nishii等〔48〕實驗，GCSP細胞接種產生的Oct3和Sox2的表達增加，提示ABCG2聯合SP細胞檢測可進一步純化GCSC。

2.7CHI3L1 殼多糖酶3樣蛋白1長度約40 kD，是一種分泌型糖蛋白。Geng等〔49〕實驗發現，在GC發展過程中CHI3L1發生上調，并且與GC的浸潤深度，TNM分期表現正相關性。CHI3L1與CD44v3結合可激活Erk，Akt和β-catenin信號傳導，從而增強GC轉移。Chen等〔50〕相關實驗也證實，CHI3L1 可作為GC患者的潛在生物標志物和潛在治療靶標。

GC早期診斷可為患者提供了內鏡下微創切除的機會。在Min等〔51〕的研究中發現，正常人群標本中CHI3L1的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)為0.788，將血漿CHI3L1水平與臨床因素結合，使AUC進一步提高至0.887。提示血漿CHI3L1可作為GC患者內鏡下可切除的潛在生物標志物。

2.8Musashi-1 Musashi-1簡稱Msi-1，分子量為39 kD，Msi-1最早于果蠅中被檢測出。已證實對感覺器官相關細胞的分化有一定影響。研究也發現Msi-1在人類胃腸道干細胞中均有一定表達。綜上，Msi-1是胃腸道干細胞的潛在表面標志物之一〔52〕。

Kuang等〔53〕相關實驗發現，Msi-1和增殖細胞核抗原(PCNA)陽性細胞僅限于正常胃腺的峽部。GC中Msi-1和PCNA的表達高于高度上皮內瘤變(U=798.0，P<0.05；U=688.0，P<0.01)。且Msi-1的表達水平與淋巴結轉移和腫瘤轉移階段呈一定影響關系(χ2=12.62，P<0.01；χ2=11.24，P<0.05)。其他大量實驗〔54～56〕也發現胃黏膜不同程度病變、癌前病變(包括腸上皮化生和異型增生)和侵襲性GC中MUSASHI-1的表達均增加。由此可以發現，Msi-1(+)細胞可能在GC癌前病變或發生早期過程中起著決定作用，并可能參與GC侵襲和轉移，可作為GC患者預后及診斷的標志。

2.9ALDH1 ALDH1由5.3×104個堿基對構成，主要分布于消化、內分泌及生殖系統中，而在大腦及小腦中還沒有發現ALDH1的表達〔57〕。它定位于9號染色體長臂上的21區。

ALDH1存在6種亞型，不同亞型的表達與GC預后、侵襲及轉移的密切性也不同。Wakamatsu 等〔58〕實驗發現，ALDH1的表達與晚期臨床病理因素顯著相關。在原發性和轉移性部位的GCSC標記比較表明，彌漫型淋巴結轉移中ALDH1陽性率明顯高于原發性腫瘤(P<0.001)；相關研究〔59～61〕表明ALDH1A1、ALDH1B1的高水平表達mRNA可能是GC中良好的預后標志物。高轉錄水平ALDH1A2、ALDH1A3、ALDH1L1會促進GC的進展和轉移，提示也可作為GC預后不良生物標志物。同時Li等〔62〕研究表明，ALDH1A3和ALDH1L1的高表達與總體生存率(OS)惡化呈現明顯相關，提示ALDH1A3和ALDH1L1是GC中ALDH1活性的潛在主要貢獻者。因此，理論上不同高程度表達的ALDH1同工酶均可作為GC患者預后診斷的重要標志，但現實實驗中還是以ALDH1A3和ALDH1L1運用較多。

2.10miRNA 微小RNA是一類長20～25個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，通過降解核糖核酸或抑制翻譯的方式進而調節一系列分化、發育等。

Peng等〔63〕實驗發現miRNA-194具有致癌性，在GC中異常上調，并通過抑制融合抑制因子(SUFU)的表達而激活Wnt信號通路來上調腫瘤的增殖和遷移。但是在其他相關實驗〔64～66〕結果顯示miRNA-194在GC組織中表達下調。鑒于其結果的不一致，應綜合因素進一步完善實驗。雖然存在結果的不一致性，但實驗結論均支持miRNA-194在GC中作為診斷或預后標志物的潛力。

大量實驗〔67～70〕發現，miR-214可作為GCSC標志物。miR-214在GC中顯著下調。大致機制是通過靶向腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)中的成纖維細胞生長因子(FGF)9和調節GC細胞中的EMT過程來降低CAFs對GC的促腫瘤作用，提示CAFs中的miRNA-214/FGF9是GC治療方法的潛在靶標。此外，Jiang等〔71〕通過對從GEO數據庫獲得的GC患者miRNA，mRNA和circRNA表達譜分析發現，共存在5種不同的表達譜(P<0.05)，即Hsa-miR-1，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-95，hsa-miR-133a，hsa-miR-375。表達譜中前四者在GC中上調，最后一個在GC中下調。同時，相關實驗〔72～74〕也發現，其他miRNA(miR-103a-3p、miR-124、miR-29b、hsa-miR-194等)均對GC組織具有一定影響。以上研究均提示各種特定miRNA具有作為GC預后生物標志物的臨床潛力。

2.11SOX2 SOX2是Sox家族(B組B1亞組)成員之一，呈現單外顯子結構，定位在3號染色體長臂。

近年來，越來越多實驗〔75～77〕發現，SOX2的異常表達與GC的發生發展及不良預后有密切關系。在Wang等〔78〕和Chen等〔79〕實驗也證實了在GC發展過程中，SOX2逐漸下調。SOX2水平低與病理分期和臨床結果有關。多變量分析表明SOX2蛋白表達是GC的獨立預后指標。同時，高SOX2表達水平的患者預示著治療效果更好。Luo等〔80〕實驗顯示外源表達的SOX2抑制細胞增殖，SOX2過表達的細胞表現出細胞周期停滯和凋亡現象。遷移實驗分析表明SOX2在GC細胞中具有抗轉移作用。在SOX2過表達的GC細胞中細胞周期蛋白(CCN)D1和二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)被下調，并與SOX2誘導的抗癌作用有關。以上均說明SOX2是GC的有希望和有利的轉移生物標志物，可被用于評估GC結果的新指標。

2.12Nanog 同源域蛋白Nanog定位于人染色體上12p13區，是維持多潛能胚胎干細胞的關鍵轉錄因子?，F階段證實其在絕大多數腫瘤中表達水平都明顯提高，并對這些腫瘤的發生、發展及治療的關鍵環節具有密切影響〔81,82〕。

劉劼等〔83〕通過檢測(免疫組化SP法)，詳細分析了GC、癌旁、癌前病變組織。實驗顯示Nanog陽性率在癌前病變組織(23.3%)<癌旁組織(38.8%)

2.13Oct-4 Oct-4是POU5F1基因(POU家族)編碼的一種特異蛋白質。這種基因所表達的蛋白質可以作為未分化細胞的標記，并且是胚胎干細胞具有強大更新作用的關鍵原因〔86,87〕。

Javanbakht等〔88〕研究發現，腫瘤組織中的Oct-4 mRNA水平與正常組織相比呈一定上升趨勢。其中淋巴結轉移(P=0.001)等因素也會影響Oct-4的表達。提示Oct-4的高表達也與GC的進展和不良預后有關。田浩等〔89〕的研究中證實，Oct-4 mRNA高表達水平(P<0.001)能獨立預測患者較差的OS。

DNA結合蛋白抑制劑ID-1(ID1)在腫瘤發展及胚胎干細胞自我更新速度和多能性中起著至關重要的作用。Li等〔90〕實驗發現ID1在GC中起癌基因的作用，并通過靶向Nanog和Oct-4調節GC細胞的干細胞樣特性。提示ID1、Nanog及Oct-4均可作為新興治療靶標的切入點。