脾癉寧對糖調節受損大鼠脂肪中NF-κB通路調控作用的實驗研究

劉 洋，王 東

（1.遼寧中醫藥大學，沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110847）

葡萄糖調節受損（Impaired glucose regulation，IGR）即糖尿病前期（pre-diabetes），是代謝正常的人群向糖尿病（DM）轉化的中間階段。有研究顯示，中國成年人口中，糖尿病前期患病率為50.1%，且男性多于女性[1]。這近一半人口的數據，使得對糖尿病前期進行干預和藥物治療，越來越成為人們關注的重點。根據2017 年《中國2 型糖尿病防治指南》所述，糖尿病前期屬中醫脾癉范疇[2]。過食肥甘致內熱中滿，導師王東教授從事內分泌臨床及基礎研究多年，針對內熱中滿組方脾癉寧，本研究旨在探討脾癉寧對糖調節受損大鼠調節糖、脂代謝的作用機制，為脾癉寧的臨床應用奠定理論基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級Wistar 大鼠100 只，雄性，60～70 日齡，體質量（220±20）g。購自遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001。購入后，飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心，SPF 級動物室，飼養許可證號：SYXK（遼）2013-0009。自由食水，12 h 晝夜節律。

1.2 大鼠飼料 常規飼料：13.4 kJ/g，其中脂肪提供熱量占10.2%，蛋白質占23.3%，碳水化合物占66.5%。購于北京華阜康生物技術有限公司。高糖高脂飼料：24.4 kJ/g，其中脂肪提供熱量占49.9%，蛋白質占6.2%，碳水化合物占43.7%。購自遼寧中醫藥大學實驗動物中心。

1.3 藥品試劑 脾癉寧由佩蘭、黨參、黃連等藥物組成，中藥飲片購自遼寧中醫藥大學附屬醫院門診藥局，上述飲片，以蒸餾水500 mL 浸泡1 h，常規煎煮，最終制備成含生藥2 g/mL 的中藥湯劑，4 ℃保存備用。二甲雙胍片，購自中美上海施貴寶制藥有限公司，臨用時用蒸餾水配成16.7 mg/mL 的混懸液。兔抗大鼠TNF-α、NF-κB 抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司。RT-PCR試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.4 儀器設備 血糖儀：舒霖伴侶GM260，華廣生技術股份有限公司；血糖試紙：舒霖伴侶血糖試紙，華廣生技術股份有限公司；電泳儀，ES200 型，天能公司生產；垂直電泳槽，EV-180 型，天能公司生產；凝膠成像分析系統，SF4200 型，天能公司生產。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 大鼠適應性飼養1 周后，采用隨機數字法，將100 只雄性大鼠隨機分為2 組：空白對照組（20 只）和造模組（80 只）。然后對造模組大鼠采用高糖高脂飼料誘導法建立葡萄糖調節受損大鼠模型，模型評價成功后，將造模成功的大鼠再次隨機分為模型對照組、脾癉寧組和二甲雙胍對照組。

2.2 模型復制 對造模組大鼠采用高糖高脂飼料誘導法，建立葡萄糖調節受損模型。造模組大鼠給予高糖高脂飼料喂養，自由進食水，室溫控制在18～20 ℃，相對濕度30%～70%。連續喂養12 周。空白對照組大鼠以常規飼料喂養。

2.3 模型評價

2.3.1 評價方法 12 周后進行糖耐量實驗（OGTT）：禁食8 h 后鼠尾采血用快速血糖儀測空腹血糖（FBG），以50%葡萄糖注射液2 g/kg 體質量灌胃，2 h 后再次鼠尾采血測餐后血糖（2 hPG）。

2.3.2 成模標準 計算空白對照組大鼠空腹血糖及OGTT 2 hPG 參考值范圍（空腹血糖：空白對照組大鼠平均FBG1.96S,OGTT 2 hPG：空白對照組大鼠平均2 hPG1.96S,S：空白對照組大鼠空腹血糖及2 hPG 的標準差）。以空白對照組大鼠血糖為標準，造模組以FBG 或2 hPG 高于空白對照組相應血糖值上線（空腹血糖：空白對照組大鼠平均FBG+1.96S,OGTT 2 hPG：空白對照組大鼠平均2 hPG+1.96S），并且FBG ＜7.0 mmol/L、OGTT 2 hPG ＜11.1 mmol/L 以及任意時間血糖＜16.7mmol/L 的大鼠為建模成功[3]。

2.4 干預方法 模型評價后，共計造模成功43 只，將造模成功的大鼠隨機分為3 組：模型對照組（14只）、脾癉寧組（15 只）、二甲雙胍對照組（14 只）。空白對照組：5 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，每日1 次，連續4 周。模型對照組：5 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，每日1 次，連續4 周。脾癉寧組： 10 g/（kg·d）脾癉寧湯劑灌胃，每日1 次，連續4 周。二甲雙胍對照組：150 mg/(kg·d)二甲雙胍懸液灌胃，每日1次，連續4周。

2.5 樣本采集 末次給藥后1 h，各組大鼠經尾尖采血，測定血糖。然后以過量麻醉法處死大鼠，置于冰面上，剖開下腹部，采集附睪周圍的脂肪組織，置于2 mL 凍存管中，于-70 ℃冰箱中凍存，其中隨機抽取6 例樣本用于RT-PCR 檢測，再隨機抽取6 例樣本用于western-blot 檢測。

2.6 指標檢測

2.6.1 血糖 造模后大鼠進行糖耐量試驗。分別于給藥前和末次給藥后1 h，斷尾采血，用舒霖伴侶GM260 血糖儀和血糖試紙測定血糖。

2.6.2 脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 的表達 采用RT-PCR 法檢測各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NFκB mRNA 的表達。Trizol 抽提法提取脂肪組織中總RNA，測定濃度及質量后，采用一步法RT-PCR 試劑盒，以β-actin 為內參，對TNF-α、NF-κB 相應引物進行擴增，引物序列詳見表1。擴增產物與1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像分析系統中采集圖像，并測定目的基因和內參基因擴增條帶的積分光密度值，并以目的基因積分光密度值/內參基因積分光密度值的比值作為該例樣本目的基因的相對表達水平，進行統學分析。

表1 引物序列表

2.6.3 脂肪組織中TNF-α、NF-κB 蛋白的表達 采用western-blot 法檢測各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB的表達。采用裂解法提取脂肪組織中總蛋白，蛋白定量后，加入loading buffer，沸水浴5 min，以30 μg/孔的蛋白量進行上樣電泳，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，一抗（1:200）4 ℃孵育過夜，二抗（1:1 000）室溫孵育2 h，洗膜后置于凝膠成像分析系統中，滴加ECL 工作液，曝光60 s，采集圖像，并測定目的蛋白和內參蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內參條帶灰度值的比值作為該例樣本目的蛋白的相對表達水平，進行統計學分析。

2.7 統計學方法 各組實驗數據應用 SPSS 16.0 統計軟件包進行統計學分析，計量資料均以均數±標準差（）表示，2 組間比較采用t檢驗，3 組及以上組間比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA）。

3 結果

3.1 模型評價 造模后，空白對照大鼠FBG 為4.54 mmol/L，2 hPG 為6.73 mmol/L。因此空白大鼠FBG+1.96S 為6.5 mmol/L，2 hPG+1.96 S 為8.69 mmol/L。測得各組FBG 及2 hPG 結果后，符合FBG 高于6.5 mmol/L，低于7.0 mmol/L；OGTT 2 hPG 高于8.69 mmol/L，低于11.1 mmol/L；隨機血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠共計43 只[4]。

3.2 用藥前及用藥后各組大鼠體質量比較 見表2。

表2 用藥前及用藥后各組大鼠體質量比較（） g

表2 用藥前及用藥后各組大鼠體質量比較（） g

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△△P ＜0.01

3.3 用藥前各組大鼠FBG、2 hPG 比較 各組大鼠給藥前及給藥后血糖檢測結果顯示：給藥前，模型對照組、脾癉寧組及二甲雙胍對照組大鼠空腹血糖及OGTT2 h 血糖均顯著高于空白對照組，有統計學差異（P＜0.01）；而模型對照組、脾癉寧組及二甲雙胍對照組3 組大鼠的空腹血糖及OGTT2 h 血糖無顯著性差異（P＞0.05）。給藥后，與模型對照組比較，脾癉寧組及二甲雙胍對照組大鼠空腹血糖均顯著降低（P＜0.05 或0.01），但脾癉寧組大鼠空腹血糖高于正常對照組（P＜0.01），二甲雙胍對照組大鼠與空白對照組大鼠空腹血糖無顯著性差異（P＞0.05），見表3。

表3 用藥前各組大鼠FBG、2 hPG 比較（） mmol/L

表3 用藥前各組大鼠FBG、2 hPG 比較（） mmol/L

注：與空白對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與脾癉寧組比較，▲P ＜0.05

3.4 TNF-α、NF-κB mRNA 表達水平 各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 表達檢測結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組、脾癉寧組和二甲雙胍對照組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 的表達水平均顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，脾癉寧組和二甲雙胍對照組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 的表達水平均顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.01）；脾癉寧組與二甲雙胍對照組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA表達水平無顯著性差異（P＞0.05），見表4，圖1。

表4 各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 表達水平（，n =6）

表4 各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 表達水平（，n =6）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△△P ＜0.01

圖1 各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 表達電泳圖

3.5 TNF-α、NF-κB 蛋白表達水平 見表5，圖2。

表5 各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB 蛋白表達水平（，n =6）

表5 各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB 蛋白表達水平（，n =6）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型對照組比較，△△P ＜0.01

圖2 各組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB 表達曝光照片

4 討論

《素問·奇病論》曰：“有病口甘者，病名為何，何以得之?岐伯曰：此五氣之溢也，名曰脾癉。”知其癥狀為口甘，病位在脾。內經認為其病機為內熱中滿，用一味蘭草湯，除陳解郁以療之。古籍記載以及近代的文獻報道表明，脾癉應屬于中醫消渴病的前期階段，糖尿病患者從早期的無明顯癥狀到有口渴或善饑等癥狀之前這一階段,均屬于中醫的“脾癉”范疇[5-6]。脾癉寧就是針對該病理階段證型特征而擬定的治療糖尿病前期，葡萄糖調節受損階段的中藥方劑。脾癉寧方由佩蘭、蒼術、黨參、黃精、黃芪、黃連、大黃、茯苓、澤瀉、葛根組成，以“治未病”為理論基礎[7-8]，以“脾主運化”為主要治則[9]。

葡萄糖調節受損即糖尿病前期，包括空腹血糖受損和糖耐量減低，是2 型糖尿病的高危人群。報道顯示，適當干預該階段患者，可有效預防2 型糖尿病的發生和發展[10-11]。因此，出于對2 型糖尿病的預防，IGR已經受到了眾多臨床及基礎研究人員的高度重視。2 型糖尿病是由于胰腺功能出現障礙或胰島素分泌缺陷，機體糖、蛋白質、脂肪調節功能受損，以高血糖為特征的一種常見代謝性疾病。研究表明，炎癥反應機制是機體發生胰島素抵抗的主要原因之一[12]，TNF-α 等炎性因子通過多重路徑減少胰島素介導的葡萄糖和脂肪轉運，從而誘發胰島素抵抗，進而發展為糖尿病[13]。而NF-κB 信號通路是介導炎癥反應的主要信號通路之一，報道表明，TNF-α、IL-6 均受到了NF-κB 信號的調控[14-19]。同時，過表達的TNF-α 等炎性因子又導致了NF-κB 信號通路的激活，從而循環重復加重炎癥反應的發生，最終導致了糖、蛋白質、脂肪代謝的異常，發生糖尿病。因此，調控TNF-α/NF-κB 途徑成為糖尿病防治的重要靶點[20-21]。

本研究采用高糖高脂喂養法誘導糖調節受損的大鼠模型，模型評價結果顯示：造模后，以空白對照大鼠FBG 和2 hPG 的上限6.5 mmol/L 和8.69 mmol/L 為標準，符合FBG 高于6.5 mmol/L，低于7.0 mmol/L；OGTT 2 hPG 高于8.69 mmol/L，低于11.1mmol/L；隨機血糖低于16.7 mmol/L 的大鼠共計43 只，造模成功率僅為54%。分析成功率低的原因：糖調節受損狀態為糖耐量異常階段，該階段臨床診斷標準對血糖值要求嚴格，為了更貼切的模擬臨床糖調節受損患者的基本狀態，我們在本次研究中，嚴格按照臨床糖耐量異常的標準對模型進行篩選。盡管模型成功率不高，但是通過高糖高脂飼料連續喂養12 周的方案，可復制出穩定的葡萄糖調節受損大鼠模型。

脾癉寧干預后，體質量及血糖檢測結果表明，脾癉寧可顯著降低糖調節受損模型大鼠的體質量，提示脾癉寧可能具有調節脂代謝的作用。此外，脾癉寧還可以降低糖調節受損模型大鼠空腹血糖和餐后2 h 血糖，尤其是餐后2 h 血糖，其作用于二甲雙胍相當。提示脾癉寧具有調節血糖作用。但其調節脂代謝和血糖的作用機制尚不能確定。

因此，我們繼續進行了相關機制研究。對各組大鼠附睪周圍脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 及蛋白表達水平進行了檢測。結果表明：與空白對照組比較，模型對照組、脾癉寧組和二甲雙胍對照組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA 及蛋白的表達水平均顯著上調。提示在糖尿病早期，糖調節受損階段，機體內介導慢性炎癥的信號已經開啟。脂肪組織中慢性炎癥的發生可能是脂代謝異常的作用機制之一。與模型對照組比較，脾癉寧組和二甲雙胍對照組大鼠脂肪組織中TNF-α、NF-κB mRNA及蛋白的表達水平均顯著下調，提示脾癉寧與二甲雙胍具有抑制糖調節受損大鼠脂肪組織中慢性炎癥的作用，但二者作用機制不同。二甲雙胍的抑制促炎因子及促進抗炎因子表達的機制是多通路，多途徑的[22]。而脾癉寧的作用機制尚不明確。本研究顯示，脾癉寧可有效抑制糖調節受損大鼠脂肪組織中TNF-α 和NF-κB mRNA 及蛋白的表達水平，提示我們脾癉寧抑制NF-κB 信號通路的過度活化作用可能是其抑制慢性炎癥反應，調節脂代謝和糖代謝的作用機制之一。

綜上所述，脾癉寧具有與二甲雙胍相類似的調節體質量（脂肪代謝）、血糖、餐后2 h 血糖的作用。抑制TNF-α、NF-κB 過表達可能是其作用機制之一。