毒痰瘀脾虛方含藥血清對HepG2肝癌細胞增殖及VEGF的影響

潘 誼，吳輝坤,2,3*

（1.湖北中醫藥大學，武漢 430065；2.湖北省中醫藥研究院，武漢 430074；3.湖北省中醫院，武漢 430061）

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率在全球惡性腫瘤中居第6 位，病死率居第2 位[1]。傳統的治療方法除手術及放、化療外，中醫中藥在肝癌的治療中也發揮了重要的作用[2]。在中醫上，無“肝癌”這一病名，根據其臨床表現，將其歸為“積聚”“黃疸”“臌脹”“脅痛”等范疇，目前多稱之為“肝積”[3]。關于肝癌證候要素的理論觀點有很多，如錢英教授認為肝郁脾腎氣血虧，痰濕疫毒為原發性肝癌的基本病因病機[4]。張建軍教授認為正氣與陰陽平衡在肝癌的發生與發展起著重要作用[5]。魏睿等[6]提出肝癌的病機為脾胃氣虛，痰濕瘀互阻。胡文雷等[7]認為本病外因是由感受邪毒、肝郁氣滯等引起，而正氣虧虛、臟腑功能失調是導致發病的根本所在，正虛以肝、脾、腎三臟虛為主，邪實以瘀血、濕熱毒邪為主。湖北省中醫院肝病研究所在長期的臨床實踐和科學研究中，提出了“毒痰瘀虛”為原發性肝癌的證素特點[8]。本研究是基于前期采用HepG2 肝癌荷瘤小鼠模型，針對毒、痰、瘀、虛各證候要素的中藥進行篩選和優化，形成中藥復方，將中藥復方按照證候要素“毒痰瘀虛”的組方特點進行拆方，組方，形成針對毒痰瘀虛不同方面的中藥復方，毒痰瘀脾虛方是在證候要素毒痰瘀的基礎上，兼顧證候要素脾虛，進行組方而形成的。本研究從細胞實驗方面著手，通過CCK8 法觀察毒痰瘀脾虛方對HepG2 細胞增殖的影響，ELISA 法觀察毒痰瘀脾虛方對HepG2 細胞內皮生長因子（VEGF）表達的影響。

1 實驗材料

人肝癌HepG2 細胞，武漢巴菲爾生物技術服務公司提供。SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質量180～220 g 購置武漢大學實驗動物飼養中心，許可證號：SYXK（鄂）2017-0095。微型高速離心機（美國Labnet，型號：C2500-R-230V）；倒置顯微鏡（NIKON，型號：Ts2型）；ICV-450 型電熱恒溫培養箱（日本ASONE，型號：ICV-450）；全自動酶標儀（Thermoscientific，型號：MultiskanMK3）；超凈工作臺（蘇州集團安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-2FD）等。RPMI-1640 培養基（Gibco，貨號：C11875500BT）；胎牛血清（GIBCO，貨號：10099-141）；人VEGF 酶聯免疫吸附測定試劑盒（欣博盛，貨號：EHC108）；CCK-8 試劑盒（Beyotime，貨號：E1CK-000208）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗，100×）（Procell，貨號：PB180120）；PBS（Procell，貨號：PB180327）；二甲基亞砜(細胞級)（Sigma-D4540，貨號：67-68-5）。毒痰瘀脾虛方由中藥葉下珠10 g，半枝蓮15 g，白花蛇舌草15 g，天葵子20 g，旋覆花10 g，皂角刺10 g，丹參20 g，姜黃20 g，黨參30 g，炙黃芪30 g，白術30 g 組成（劑量參考中藥大辭典），中藥購自湖北省中醫院中藥房，由湖北省中醫院制劑室加工成濃縮液含生藥2 g/mL，4 ℃保存備用；索拉非尼（200 mg/粒）購自德國拜耳制藥公司，產品批號：BXHX072。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備 將Wistar 大鼠隨機分為空白對照組、索拉非尼組、毒痰瘀脾虛方組，每組大鼠各3 只。根據人和動物體表面積折算的等效劑量比率表，中藥灌胃劑量以10 mL/kg 計算，索拉非尼組以50 mg/kg 的劑量灌胃，每日2 次（每次間隔4 h），連續5 d，于末次給藥后1 h，乙醛麻醉，無菌條件下，經腹主動脈采血，冷置1 h 后，離心（2 500 r/min，25 min），分離血清，放置56 ℃水浴中滅活30 min，-20 ℃冰箱保存備用[9-10]。取血清加入RPMI-1640 培養液中，制成含10%含藥血清培養液。

2.2 細胞培養 人肝癌HepG2 細胞用含10%胎牛血清RPMI-1640 培養液在37 ℃5%CO2培養箱中常規培養，細胞長到80%時，加入1～2 mL 胰蛋白酶消化細胞進行傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.3 實驗分組 實驗分為空白對照血清組、索拉非尼含藥血清組、毒痰瘀脾虛方含藥血清組。

2.4 CCK8 法檢測細胞增殖 取對數生長期良好的HepG2 細胞，0.25%胰酶消化后，用RPMI-1640 培養基（10%FBS+1%雙抗）調整細胞密度到5×104/mL，接入96 孔板，每組3 個復孔，每孔100 μL 細胞懸液，并設置空白孔，在細胞孔周圍孔內加入100 μL 無菌PBS，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養過夜。細胞過夜培養貼壁后，吸去培養基，分別加入200、500、1 000 ng/mL 毒痰瘀脾虛方含藥血清培養基，每孔200 μL，5%CO2，37 ℃常規培養，培養24、48、72 h 后，棄掉上清，每孔加入20 μLCCK8，37 ℃培養2～4 h，于450 nm波長處，用酶標儀測定各孔吸光值（OD值），并計算細胞增殖抑制率。細胞生長抑制率（%）＝（空白對照組OD 值－實驗組OD 值）/空白對照組OD 值×100%。

2.5 ELISA 檢測各組細胞上清液中VEGF 的表達 取對數生長期良好的細胞，0.25%胰酶消化并用臺酚藍染色計數，用含15%胎牛血清RPMI-1640 培養基（10%FBS+1%雙抗）制成5×104/mL 的細胞懸液，接種于24 孔培養板中，每組3 個復孔，每孔100 μL 細胞懸液。分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL。給酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min。棄去孔內液體，每個孔中加入生物素化抗體工作液100 μL，酶標板加上覆膜，37 ℃溫育1 h。棄去孔內液體，每孔加酶結合物工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育30 min。棄去孔內液體，每孔加底物溶液100 μL，酶標板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。每孔加終止液100 μL，終止反應，立即用酶標儀在450 nm 波長測量各孔的光密度（OD 值），繪制標準曲線，計算樣品的相應濃度。按照人VEGFELISA 檢測試劑盒說明進行操作。

2.6 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計分析軟件對數據進行統計學處理，計量資料數據以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA）。

3 結果

3.1 毒痰瘀脾虛方含藥血清對細胞生長抑制的影響 CCK8 檢測結果顯示，隨著藥物濃度的升高，毒痰瘀脾虛方含藥血清對HepG2細胞的抑制作用越明顯，且具有明顯的濃度依耐性和時間依耐性，與空白對照組相比差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。見表1、表2。

表1 不同濃度含藥血清對HepG2 細胞生長抑制的影響

表2 不同作用時間對HepG2 細胞生長抑制的影響（，n =3）

表2 不同作用時間對HepG2 細胞生長抑制的影響（，n =3）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.01

3.2 毒痰瘀脾虛方含藥血清對HepG2 細胞VEGF 表達的影響 見表3。

表3 各組培養液中VEGF 的蛋白濃度（，n =3）ng/mL

表3 各組培養液中VEGF 的蛋白濃度（，n =3）ng/mL

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與索拉非尼組比較，△△P ＜0.01

4 討論

原發性肝癌惡性程度高，預后差[11-12]，典型特征就是大量新生血管的形成,并受多種細胞因子的調控，VEGF 是血管形成的重要調節因子，參與腫瘤的形成及發展的多個過程，具有促進新生血管形成，增加血管通透性、促進內皮細胞的增殖、抑制細胞凋亡的生物學功能[13]。腫瘤快速生長的過程中，需要血液供應的支持，VEGF 是促進腫瘤血管生成的核心細胞因子，VEGF 水平的上升或下降標志著腫瘤的形成或減退[14]。肝癌細胞的無限增殖是肝癌難控制的主要原因之一[15]，抑制肝癌細胞的增殖是抑制肝癌發生發展的主要途徑之一，許多中藥可抑制肝癌細胞增殖，發揮抗腫瘤作用[16-18]。因此，發現具有抑制肝癌細胞增殖和血管生成的中藥復方，在中醫治療肝癌方面具有重要意義[19-20]。

肝癌的證候要素是毒痰瘀虛，肝癌的發生發展多由于正氣內虛、陰陽失調，復因感受邪毒、情志郁結、飲食不節、宿有舊疾等因素損傷人體正氣，臟腑功能失調，氣血津液運行失常，產生氣滯、血瘀、痰濁、熱毒等病理變化，蘊結于肝臟，相互搏結，日久形成肝癌。在肝癌發生發展的不同時期，毒痰瘀虛四大證候要素的表現輕重不一[16]。周仲瑛教授認為肝癌的病因與癌毒、飲食、情志、外邪、肝病久延、素體稟賦有關，其中癌毒是最根本的原因[21]。張婷等[22]重視脾在肝癌發生中起的重要作用，認為脾虛是根本。劉嘉輝等[23]提出肝癌的病機本質是正虛邪實：正虛以脾虛為突出，邪實以邪氣內蘊、熱毒血瘀等為突出。林敏等[24]認為，正氣虛損、臟腑失調是原發性肝癌發生發展的基本前提；癌毒內生、邪毒盤踞是其發生發展的根本原因；氣滯血瘀、絡脈痹阻是其發生發展的重要因素；濕熱痰濁、諸邪相攻是其發生發展的致病關鍵。吳云等[25]認為，肝癌是在正氣虧虛、臟腑失和的基礎上，痰、濕、瘀、毒等各種病理因素相互膠著，日久積滯而發，且邪越盛而正越虛，病變錯綜復雜。以上各醫家對肝癌病因病機的認識側重點雖有不同，但總的不離肝癌“毒痰瘀虛”的證候要素特點。

中藥復方毒痰瘀脾虛方在組方上兼顧了肝癌毒、痰、瘀、脾虛4 個證候要素，其中葉下珠、半枝蓮、白花蛇舌草、天葵子針對證候要素“毒”；旋覆花、皂角刺針對證候要素“痰”；丹參、姜黃針對證候要素“瘀”；黨參、黃芪針對證候要素脾氣虛；全方共奏解毒、化痰、祛瘀、補益脾氣之效。

本研究運用血清藥理學方法[26]在大鼠中獲得毒痰瘀脾虛方含藥血清，通過CCK8 法和ELISA 法證實了毒痰瘀脾虛方具有抑制細胞增殖活性和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，抑制血管生成的作用（P＜0.01）。