人參皂苷Rh2調控PI3K/Akt促進大鼠骨髓間充質干細胞增殖的作用

張春玲，王賀玲，盧 艷*

（1.廊坊長征醫院心內科，河北 廊坊 065000；2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院 心內科，哈爾濱 150000）

骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是一種來源于胚胎發育時期的中胚層細胞，具有較強的自我復制和多項分化潛能的成體干細胞[1]。既往研究證實BMSCs 在特定的環境和培養條件下能夠分化成為多種功能性細胞，如心肌細胞、內皮細胞、脂肪細胞以及成骨細胞等[2-3]。近年來，心血管疾病以及腫瘤發病率已經成為危害人類健康重要殺手。有關抗血管性疾病（糖尿病血管病變、冠心病、高血壓以及肺病等）藥物和抗腫瘤藥物已經廣泛應用于臨床。但是臨床藥物的使用并不能從根本上改善患者的機體狀態。因此，越來越多的研究者將目標投向干細胞治療，BMSCs 因為具有易于分離和培養、生長迅速以及多項分化和低免疫等特點在治療心血管疾病以及腫瘤中發揮重要作用[4-5]。通過揭示BMSCs 的增殖和分化機制對疾病相關干細胞治療具有重要意義。

人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2，Rh2）作為人參的主要有效成分之一，具有廣泛的抗腫瘤活性以及治療心血管病變等作用[6-7]。王樂等[8]研究發現Rh2 能夠顯著增加催產素誘導BMSCs 向心肌細胞轉化作用。既往研究發現，Rh2 能夠調控PI3K/Akt 信號通路抑制腫瘤細胞的增殖[7]。另外，PI3K/Akt 在對多種類型細胞增殖中發揮重要作用，包括參與了BMSCs 增殖[9]。因此，本研究擬通過分離培養大鼠BMSCs 探究Rh2 能否通過調控PI3K/Akt 信號通路促進BMSCs 增殖作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SPF 級SD 大鼠共2 只，周齡3～6周，體質量為180～220 g，購買于凱學生物科技（上海）有限公司（生產許可證號：SCXK（滬）2017-0006），適應性喂養1周，期間飼養環境為12 明暗交替，自由飲水，飲食。細胞組織勻漿儀（H22539，武漢維塞爾生物科技有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（DW-86L578J，青島海爾集團）；4 ℃、-20 ℃冰箱（FYLYS-128，合肥美菱股份有限公司）；高速臺式冷凍離心機（SKFH-1600RW，湖南湘儀實驗室儀器有限公司）；Western blot 檢測裝置（125-0098，美國Bio-Rad 伯樂公司）；高純水機（CSB-20L，美國Millipore 公司）；酶標儀器（HBS-1096A，上海研卉生物科技有限公司）。人參皂苷Rh2（上海順勃生物工程技術有限公司，純度＞98%）；LY294002（美國Cell Signaling Technology公司）；L-DMEM 細胞培養基（C11960500BT，gibco公司）；成脂、成骨誘導分化培養基（濟南中賽生物）；胎牛血清（10099-141，gibco 公司）；PI3K 抗體（△13158，美國Cell Signaling Technology 公司）、Akt抗體（△24232，美國Cell Signaling Technology公司）、p-Akt 抗體（△12703，美國Cell Signaling Technology公司）、β-actin 抗體（△54943，美國Cell Signaling Technology 公司）；HRP 標記兔二抗（A0227，武漢博士德公司）、HRP 標記鼠二抗（A0286，武漢博士德公司）；一抗稀釋液（P0256，江蘇碧云天公司）、二抗稀釋液（P0023D，江蘇碧云天公司）；CCK-8 檢測試劑盒（AF0216，江蘇碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質干細胞分離與培養 利用頸椎脫臼法處死大鼠，并在無菌條件下分離大鼠四肢長骨盡量去除殘多余殘留組織。使用磷酸緩沖鹽溶液（含有1%青鏈霉素）混合溶液多次沖洗大鼠長骨兩端使其暴露髓腔，隨后通過注射器吸取適量的DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔，收集得到細胞。最后將收集得到的骨髓腔細胞放置于DMEM 細胞培養基（含10%胎牛血清）中重懸，接種于面積為25 cm2培養瓶中，培養環境在設置溫度37 ℃、CO2含量5%的細胞培養箱內培養。培養期間每隔2～3 d 進行細胞換液處理，待細胞融合度達到80%～90%結束原代細胞培養，顯微鏡下觀察細胞形態。[3]

1.2.2 細胞純化 原代骨髓間充質干細胞培養1～2周且融合度達80%～90%后進行傳代培養。傳代時用0.25%胰蛋白酶（含 0.02%乙二胺四乙酸）消化2 min，胎牛血清終止消化。終止消化后按照離心機設定，轉速：1 000 r/min，離心5 min 收集細胞，最后將重懸后細胞接種于新的細胞培養瓶中。[8]

1.2.3 骨髓間充質干細胞成骨、成脂分化[7]1）成骨分化：將上述培養的細胞以密度為2×105個細胞接種至6 孔板中（6 孔板預先通過0.1%的明膠處理30 min并清洗），待細胞生長融合度達到60%～70%時，向培養板內加入誘導成骨分化的細胞培養基約2 mL。期間每隔3 d 進行細胞培養液更換。誘導分化21 d 后，通過細胞固定液固定細胞并利用茜素紅染色5 min，最后通過顯微鏡觀察著色情況并拍照。2）成脂分化：成脂分化培養包括A 液和B 液兩部分處理。首先通過采用成脂分化培養基A 液處理細胞72 h，之后改用成脂分化誘導培養基B，處理細胞24 h，之后再次使用A液體處理細胞72 h。按照上述交替操作3～5 次，最后再次使用B 液繼續誘導分化3～7 d。將上述成脂誘導后的細胞用多聚甲醛固定后，油紅O 染色約30 min，顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.2.4 CCK-8 檢測人參皂苷Rh2 對骨髓間充質干細胞增殖 將消化后的骨髓間充質干細胞按照96 孔板密度為：1×104/孔接種，細胞貼壁生長24 h 后，實驗分為對照組、人參皂苷Rh2 低劑量組、人參皂苷Rh2 中劑量組和人參皂苷Rh2 高劑量組。其中人參皂苷組采用不同濃度（10、20、40 μmol/L）人參皂苷Rh2 處理48 h，每個濃度設置6 個復孔，每孔加入CCK-8 溶液10 μL 繼續培養1 h，酶標儀設定波長為450 nm 檢測各孔的吸光度值，以OD 值反應細胞的活力。[4]

1.2.5 克隆形成實驗檢測人參皂苷Rh2 對骨髓間充質干細胞的增殖影響 將分離、純化得到的第3 代骨髓間充質干細胞中在細胞培養箱中培養分別加入總濃度為10、20、40 μmol/L 的人參皂苷Rh2，持續培養48 h。培養結束后使用PBS 清洗細胞3 次，最后采用多聚甲醛固定細胞，并用0.1%結晶紫細胞染色 10 min，PBS清洗干凈后，顯微鏡下拍照并計數骨髓間充質干細胞細胞克隆數。[9]

1.2.6 CCK-8 法檢測LY294002 對人參皂苷Rh2 促進骨髓間充質干細胞增殖影響 將骨髓間充質干細胞種植于6 孔板內貼壁生長24 h 后，待其生長融合度達到70%左右時，加入p-Akt 抑制劑LY294002（20、40 μmol/L）處理4 h后，人參皂苷Rh2高劑量處理細胞48 h，最后通過CCK-8 檢測細胞活力。[5]

1.2.7 蛋白質免疫印跡（Western blot） 1）將處理完成的NPCs 放置于1.5 mL 的組織研磨管內并按照1:4比例加入細胞裂解液放置在已經預冷后的細胞組織勻漿儀中進行研磨；2）4 ℃ 12 000×g 離心10 min，收集細胞上清液，采用BCA法進行蛋白質濃度定量檢測；3）每孔上樣量為30 μg 進行蛋白質凝膠電泳實驗，根據目的蛋白分子量大小以及蛋白marker 指示進行切膠，濕轉轉膜法將蛋白轉移至PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育對應一抗（1:1 000）4 ℃過夜，孵育二抗（1:5 000）1～2 h，于搖床搖晃洗膜，含吐溫磷酸鹽緩沖液（TPBS）洗滌后加入ECL，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計算各條帶的灰度值，以各目標條帶灰度值與內參β-actin 條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。[10]

2 結果

2.1 大鼠骨髓間充質干細胞培養與鑒定 原代大鼠骨髓間充質干細胞多呈現多角形和棱形，培養至第3 代細胞多以棱形為主并呈渦旋樣生長（圖1）。對培養至第3 代大鼠骨髓間充質干細胞進行成骨誘導分化21 d后，茜素紅染色顯示大片紅色骨結節形成，表明成骨誘導分化成功。成脂誘導分化24 d 后，油紅O 染色可見明顯紅色脂滴形成，表明成脂誘導分化成功（圖2）。

圖1 原代大鼠骨髓間充質干細胞形態學特征（×200）

圖2 大鼠骨髓間充質干細胞成骨和成脂分化（×200）

2.2 人參皂苷Rh2 對骨髓間充質干細胞增殖的影響 CCK-8 法測定Rh2 對BMSCs 增殖的影響。見表1。

表1 Rh2 對BMSCs 細胞活力及克隆數目的影響

2.3 人參皂苷Rh2 對骨髓間充質干細胞PI3K/Akt 蛋白表達的影響 為探究Rh2 對BMSCs 增殖的作用機制。Western blot 檢測了PI3K、Akt 和p-Akt 表達水平。與對照組相比，Rh2 中、高劑量組能夠顯著促進PI3K、p-Akt蛋白表達（P＜0.05 或P＜0.01）；與Rh2 低劑量組相比，Rh2 中、高劑量組PI3K、p-Akt 蛋白表達升高（P＜0.05 或P＜0.01）；Rh2 高劑量組與Rh2 中劑量組無顯著性差異（圖3，表2）。提示：Rh2 可能通過作用于PI3K/Akt 信號通路促進BMSCs 增殖。

圖3 Rh2 對骨髓間充質干細胞PI3K/Ak 蛋白表達影響

表2 相關蛋白表達水平

2.4 抑制PI3K/Akt 對人參皂苷Rh2 促骨髓間充質干細胞增殖的影響 探究人參皂苷Rh2 通過PI3K/Akt 信號通路促進BMSCs 增殖。通過Akt 抑制劑LY294002（20、40 μmol/L）處理細胞后，高劑量Rh2 處理48 h 后。Western blot 檢測顯示，與Rh2 高劑量組相比，抑制劑LY294002（40 μmol/L）組PI3K、p-Akt 表達顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。CCK-8 檢測細胞活力結果顯示，與Rh2 高劑量組相比，LY294002 抑制劑（40 μmol/L）組細胞活力顯著降低（P＜0.01）（圖4，表3）。

圖4 LY294002 抑制劑對Akt 蛋白表達影響

表3 LY294002 抑制劑對Rh2 促進BMSCs 增殖的影響

3 討論

Rh2 是人參的有效活性成分之一，具有廣泛的藥理學作用，主要包括誘導細胞分化或凋亡，抑制多種腫瘤細胞的增殖以及抗細胞炎癥等[10-11]。新近研究發現Rh2 能夠促進BMSCs 的分化作用[8]。

既往也證實，BMSCs 可以通過特定條件下增殖，分化為多種功能性細胞進而參與機體特定生物學作用，是一種有前景的治療性干細胞[12-14]。本研究首先通過對例如淋巴細胞、單核細胞以及BMSCs 等貼壁能力的差異初步純化大鼠得到BMSCs。為進一步鑒定所培養的細胞為BMSCs，在初步純化得到的細胞培養至第3 代時，對其進行成骨和成脂誘導分化。結果發現，成骨誘導分化21 d 后，茜素紅染色顯示大片紅色骨結節形成，表明成骨誘導分化成功。成脂誘導分化24 d 后，油紅O 染色可見明顯紅色脂滴形成，表明成脂誘導分化成功。以上結果表明，本研究成功分離得到BMSCs，為后續探究Rh2 對BMSCs 的生物學作用奠定了基礎。為探究Rh2 對細胞增殖的影響。本研究首先設置不同濃度梯度的Rh2（2、4、8 μmol/L）處理BMSCs 48 h，結果發現，與對照組相比，Rh2 處理組均能顯著增加BMSCs 活力并呈現濃度依賴性特點。同時細胞克隆實驗也證實，Rh2 能夠顯著增加BMSCs克隆細胞數目。那么有關Rh2 對BMSCs 的分子作用機制又是如何呢？PI3K/Akt 信號通路廣泛存在于細胞中，參與了包括細胞增殖在內的多種生物學調控過程[15-16]。磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidyl Inositol 3-Kinase，PI3K）是一類位于細胞質中的脂類激酶。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，約含480 個氨基酸殘基，又稱蛋白激酶B[17]。PIP3 可以作為第二信使，能夠將Akt 募集到質膜上，促進Akt 發生磷酸化，繼而誘導下游分子信號傳導[18]。現有研究發現，Rh2 能夠通過抑制PI3K/Akt 通路，激活p53 信號通路，促進Caspase-3 表達，導致Bcl-2/Bax 比例失調，誘導結腸癌細胞凋亡[19]。另有研究發現，表皮生長因子可以通過激活PI3K/Akt 信號，促進BMSCs 增殖和遷移[20]。基于以往文獻報道，我們推測Rh2 促進BMSCs 增殖的作用機制可能涉及PI3K/Akt 信號。通過Western blot 檢測結果發現，與對照組相比，Rh2 中劑量組和高劑量組均能夠促進PI3K 和p-Akt 表達。結合細胞增殖檢測以及PI3K/Akt 蛋白表達檢測，與對照組相比，Rh2 高劑量對BMSCs 增殖作用最為明顯。為確證Rh2 是通過PI3K/Akt信號通絡促進BMSCs增殖，通過采用p-Akt抑制劑LY294002（20、40 μmol/L）處理后結果顯示，與Rh2 高劑量組相比，40 μmol/L 的LY294002 能夠顯著下調p-Akt 表達，抑制BMSCs 增殖。

綜上所述，Rh2 能夠通過PI3K/Akt 信號通路促進BMSCs 增殖。以上研究結果將為Rh2 用于促進BMSCs 增殖提供新的分析作用機制。