沉默PKM2表達可通過Bim來影響肺鱗狀細胞癌凋亡

溫媛媛 楊志強 金丹雯 何 慧 錢立勇

丙酮酸激酶(PK),作為糖酵解的關鍵酶之一,編碼4種不同亞型,L、R、M1、M2[1,2]。PKM2主要表達在正常人類胚胎發育過程中,與組織修復和再生密切相關[3]。PKM2在腫瘤細胞能量供應、上皮-間質轉化(EMT)、細胞侵襲轉移和細胞增殖等方面發揮重要作用[4,5]。此外，PKM2還可以通過磷酸化、乙酰化等修飾作用與多種蛋白相互調控，介導PKM2在細胞內的不同定位，發揮特殊的生物學功能[6,7]。

近年來，有研究發現在肝癌中PKM2通過調節Bim穩定性來抑制細胞凋亡[8]。Bim作為Bcl-2家族BH3蛋白重要成員，在外界壓力誘導的細胞凋亡中發揮重要作用[9]。PKM2介導的肺癌細胞凋亡的分子機制尚不清楚。在肺鱗狀細胞癌中PKM2是否可通過調控Bim來影響肺癌細胞凋亡？本研究分析了PKM2在肺鱗狀細胞癌中的表達、與臨床病理參數的關系及對肺鱗狀細胞癌不良預后的影響，探討PKM2在肺鱗狀細胞癌凋亡中的作用及與Bim的關系。

材料與方法

1.標本來源與患者資料：本研究收集了舟山醫院病理診斷中心2007年1月1日～2016年12月31日的95例肺鱗狀細胞癌與癌旁正常組織標本。所有入組患者均行根治性手術切除，未行化療或放療。根據WHO肺癌組織學分類標準(2015年)確定組織學類型，根據2009年國際抗癌聯盟(UICC)的TNM分期系統進行分期。所有入組患者術前均獲得知情同意。隨訪方法為門診和電話隨訪。生存時間從手術日期至因復發/轉移而死亡日期或最后一次隨訪日期。本文隨訪數據截止日期為2016年12月，1例患者失訪。

2.主要試劑：P免疫組織化學檢測試劑盒(中國福州邁新生物技術公司)；兔抗人PKM2抗體(英國Abcam公司)，兔抗人Bim抗體(美國Santa Cruz公司)，鼠抗人β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Annexin V-FITC/PI試劑盒(英國Abcam公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0試劑盒(日本TaKaRa公司)，PCR引物合成與測序委托大連TaKaRa公司進行，PKM2 siRNA(5′-CCAUAAUCGUCCUCACCAATT-3′)和對照siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′) 由上海吉瑪生物公司設計合成，Bim siRNA購自美國Santacruz公司。

3.免疫組織化學染色及結果判定：石蠟組織制成4μm切片，按照SP法進行染色：脫蠟，水化，阻斷內源性過氧化物酶活性，抗原修復，封閉，分別滴加一抗(PKM2，1∶400)(Bim，1∶100)4℃過夜，PBS清洗后加入對應的二抗、室溫孵育1h，DAB顯色，復染，常規脫水、透明、封片，顯微鏡下判讀。半定量法評價PKM2與Bim在腫瘤區域的免疫著色。每張切片在光鏡下隨機選取5個高倍視野，每個視野計數100個細胞，并計算了陽性細胞的百分比。PKM2與Bim均以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性顯色，二者染色強度分為3個等級：0為陰性；1為中等著色；2為強著色。染色百分率分為4個等級： 1級1%～25%;2級26%～50%;3級51%～75%;4級76%～100%。以陽性細胞率和染色強度的分值乘積作為每一例的積分，積分<4者判定為陰性或低表達，積分≥4為陽性或高表達。

4.細胞培養和siRNA干擾實驗：選取人正常支氣管上皮細胞系HBE與人肺鱗癌細胞系SK-MES-1，兩種細胞均為貼壁生長的細胞系，均接種在DMEM培養液中，于37℃含5%CO2濕潤空氣的培養箱中培養。實驗分5組：未處理組、control siRNA組、PKM2 siRNA組、PKM2 siRNA+Bim siRNA組及Bim siRNA組，每個實驗均重復3次。取生長狀態良好的細胞以5×105每孔的密度接種于6孔板中進行轉染實驗，陰性對照為未轉染組與control siRNA組，siRNA 濃度為 20μmol/L，轉染具體步驟按Lipofect amine 2000試劑說明書進行。

5.蛋白提取與免疫印跡:使用細胞裂解液，對貼壁細胞進行裂解，4℃靜置24h，低溫高速離心(4℃, 12000r/min, 40min)，提取上清即為總蛋白。加樣，上樣蛋白量為60μg。經聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳1.5h后，轉印至PVDF膜，加入Western blot封閉液室溫封閉60min，洗凈，后將膜立即加入稀釋好的一抗(PKM2抗體，1∶500；Bim抗體，1∶600；β-actin抗體，1∶200)，4℃孵育過夜。TTBS洗膜3次，后加入對應的二抗室溫下孵育2h，ECL顯色，X線膠片曝光成像，經自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像。以目的條帶與內參照 β-actin 條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。重復實驗 3次。

6.RT-PCR法:細胞離心后加入 1ml Trizol 與液氮混勻，轉移至 1.5ml EP 管中，加入200μl 氯仿，經過兩次高速離心后(4℃、12000r/min、15min)，去除上清液，用 1ml 75%乙醇洗滌管壁和RNA，再經高速離心處理后，棄去上清液，即獲得細胞總RNA。利用RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0試劑盒反轉錄獲得cDNA，擴增PKM2與Bim，以β-actin為內參。PKM2 PCR上游引物： 5′-CCATTACCAGCGACCCCACAG-3′；下游引物：5′- GGGCACGTGGGCGGTATCT-3′。Bim PCR上游引物：5′-CTGCAGATA TGCGCCCAGAGAT-3′; 下游引物： 5′-CACCAGGCGGACAATGTAACG-3′。β-actin PCR上游引物：5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3′; 下游引物： 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3′。實驗重復3次，取平均值。

7.Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測凋亡：取對數生長期的細胞，以1×104個/毫升的密度接種于細胞培養瓶內，置于37℃ CO2孵箱中培養。收集細胞，加入300μl的1×binding buffer 懸浮細胞，再分別加入5μl的Annexin V-FITC與5μl的PI，室溫避光15min后加400μl PBS，使用流式細胞儀進行分析檢測，實驗重復3次，取平均值。

結 果

1.PKM2與Bim蛋白在肺鱗狀細胞癌中的表達及與臨床病理因素的關系:免疫組化結果發現，PKM2在74例肺鱗狀細胞癌組織中高表達(77.9%),免疫染色定位于細胞質。在正常支氣管及肺泡組織中不表達或低表達(圖1)。PKM2高表達與患者高TNM分期(χ2=10.146，P=0.008)、淋巴結轉移(χ2=19.011，P=0.003)及腫瘤直徑(χ2=8.848，P=0.009)相關(表1)。Bim在65例肺鱗狀細胞癌組織中低表達(68.4%)，染色定位于細胞質(圖1)。Spearman相關性表明，在95例肺鱗狀細胞癌中PKM2與Bim表達呈負相關(rs=-0.932，P=0.000，表2)。

圖1 PKM2與Bim在肺組織中的表達(SP法，×200)A、C、E.PKM2分別在肺鱗狀細胞癌、正常肺泡上皮及支氣管上皮中的表達；B、D、F.Bim分別在肺鱗狀細胞癌、正常肺泡上皮及支氣管上皮中的表達

表1 PKM2在90例肺鱗狀細胞癌中的表達及與臨床病理參數的關系

2.PKM2高表達與肺鱗狀細胞癌患者不良預后相關:Kaplan-Meier生存分析顯示，PKM2蛋白高表達組患者的總體生存期低于PKM2低表達組(χ2=18.630，P=0.000，圖2)。單因素分析表明，腫瘤體積大(χ2=9.185,P=0.038)、高TNM分期(χ2=11.453,P=0.011)、PKM2高表達狀態(χ2=18.630,P=0.000)、淋巴結轉移(χ2=19.857,P=0.000)與患者不良預后密切相關(表3)。將單因素分析中有統計學意義的4項指標引入COX風險比例回歸模型分析，多因素分析表明，淋巴結轉移(RR=2.896，P=0.003)、PKM2表達(RR=1.798，P=0.038)與患者不良預后顯著相關，分別為本組患者生存時間的獨立預測因素(表4)。

表2 PKM2與Bim在95例肺鱗狀細胞癌組織中表達相關性分析

圖2 PKM2表達情況與患者生存曲線分析

表3 95例肺鱗狀細胞癌患者總生存率的單因素分析

表4 95例肺鱗狀細胞癌患者預后的多因素分析(COX回歸模型)

3.PKM2在肺鱗狀細胞癌中高表達:鱗狀細胞癌SK-MES-1中PKM2蛋白(t=8.210，P<0.05)與mRNA(t=5.473，P<0.05)表達均高于正常支氣管上皮細胞系HBE(圖3)。

圖3 PKM2蛋白與mRNA在SK-MES-1中表達A.PKM2蛋白在肺鱗狀細胞癌SK-MES中表達高于正常支氣管上皮細胞系HBE;B.PKM2 mRNA在肺鱗狀細胞癌SK-MES中表達高于正常支氣管上皮細胞系HBE

圖4 肺鱗狀細胞癌中沉默PKM2表達后可上調Bim表達A、B、C、D.在SK-MES-1中分別沉默PKM2與Bim表達后，PKM2、Bim蛋白和mRNA 表達情況;E、F.共轉染PKM2 siRNA與Bim siRNA后，PKM2與Bim蛋白和mRNA表達情況

4.PKM2可通過Bim抑制肺鱗狀細胞癌凋亡:采用PKM2 siRNA片段與Bim siRNA片段來分別沉默PKM2與Bim表達，在SK-MES-1中轉染PKM2siRNA或 Bim siRNA 48h后收集細胞，發現PKM2與Bim在PKM2 siRNA組中表達顯著低于control siRNA組(P<0.05)，Bim在Bim siRNA組中表達顯著低于control siRNA組(P<0.05)，證明PKM2 siRNA片段與Bim siRNA片段的干擾作用是顯著的,在肺鱗狀細胞癌中沉默PKM2表達可上調Bim表達(圖4中A～D)。為了觀察PKM2對肺鱗狀細胞癌凋亡的影響，細胞轉染PKM2 siRNA 48h后采用 Annexin V-FITC/PI試劑盒處理細胞。與未處理組(10.45%±1.23%)、control siRNA組(11.32%±1.52%)比較，SK-MES-1細胞轉染PKM2 siRNA(28.01%±3.65%)后細胞凋亡率明顯增加(P<0.05,圖5)。為了探討Bim在PKM2調控細胞凋亡中的作用，SK-MES-1細胞同時轉染PKM2 siRNA與Bim siRNA(13.55%±1.74%)，與單獨轉染PKM2 siRNA(28.01%±3.65%)比較，PKM2上調Bim表達的作用明顯減弱(P<0.05,圖4中E、F)，同時細胞凋亡率明顯減少(P<0.05，圖5)。

圖5 肺鱗狀細胞癌中沉默PKM2表達可通過上調Bim來誘導細胞凋亡A.SK-MES-1各實驗組中細胞的凋亡情況；B.各實驗組中凋亡率統計，*P<0.05

討 論

PKM2已被證實在許多惡性腫瘤中高表達且與這些腫瘤的不良預后相關，例如胃癌、前列腺癌[10,11]。在638例肝細胞肝癌中，PKM2表達上調并與肝細胞肝癌的惡性臨床表型顯著相關，包括高臨床分期、血管浸潤和腫瘤直徑。PKM2高表達與肝細胞肝癌的總體生存期縮短密切相關[8]。在子宮內膜癌中高表PKM2高表達的患者總體生存率較PKM2低表達患者低[12]。PKM2高表達與食道鱗狀細胞癌的總生存期低相關[13]。本研究發現PKM2在肺鱗狀細胞癌組織中高表達，且PKM2高表達與患者高TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤直徑相關。PKM2高表達的患者的總體生存期低于PKM2低表達者，PKM2高表達與肺鱗狀細胞癌患者不良預后相關，且為患者生存時間的獨立預測因素。

PKM2可調控許多惡性腫瘤細胞的增殖與凋亡。文獻報道，采用siRNA沉默PKM2表達后可抑制腫瘤細胞生長、促進細胞凋亡[14]。PKM2通過與Bub3結合并在Y207位點磷酸化來直接調節細胞周期進展[15]。PKM2可在T11位點磷酸化組蛋白H來調控細胞周期蛋白cyclinD1與c-myc表達促進腫瘤細胞增殖[16]。這些研究報道均證實PKM2在腫瘤發生、發展中發揮著重要作用。本研究發現，采用PKM2 siRNA片段干擾PKM2表達后，凋亡檢測實驗發現，沉默PKM2可誘導細胞凋亡。

凋亡是細胞的一種程序性的細胞死亡，包括內源性和外源性凋亡途徑[17]。Bim作為Bcl-2家族重要凋亡蛋白成員之一，可激活caspase-9，誘導線粒體凋亡通路[18]。有研究發現在肝癌細胞系中沉默PKM2表達可上調Bim來誘導肝癌細胞凋亡[8]。在肺鱗狀細胞癌中，Bim是否也參與了PKM2調控的肺癌細胞凋亡？本研究就這一假設進行探討，免疫組化與統計結果表明在95例肺鱗狀細胞癌組織中PKM2與Bim表達呈負相關，同時采用特異性siRNA片段沉默PKM2表達后可上調Bim表達，共轉染PKM2 siRNA與Bim siRNA片段發現抑制PKM2表達可通過上調Bim來誘導肺鱗狀細胞癌凋亡。

綜上所述，本研究表明PKM2高表達與肺鱗狀細胞癌不良預后密切相關，PKM2可通過調控凋亡蛋白Bim表達來影響肺鱗狀細胞癌凋亡，為肺鱗狀細胞癌的診治提供新的靶點。