百菌清降解菌的分離鑒定及功能基因分析

任曉潔，賀壯壯，單 昕，趙玉斌，宋元達，趙新河,,4

百菌清降解菌的分離鑒定及功能基因分析

任曉潔1,2，賀壯壯1，單 昕1，趙玉斌3，宋元達1，趙新河1,3,4※

（1. 山東理工大學農業工程與食品科學學院，考林臘特列杰微生物脂質國際研究中心，淄博 255000；2. 保齡寶生物股份有限公司，德州 253000；3. 魯洲生物科技有限公司，臨沂 276400；4. 重慶市科學技術研究院，重慶 401123）

百菌清是一種廣譜非內源性農藥，在土壤中難以降解，已經成為農業環境污染的主要污染源之一。因此，其對環境的污染和被污染土壤的修復技術越來越受到關注。土壤環境中原位降解細菌的多樣性對于評價環境毒理學、生物降解性、自凈化能力和污染物的修復潛力具有重要價值。該研究從長期被百菌清污染的土壤中收集大量樣本，分離到了14種能夠明顯降解百菌清的細菌。根據菌株形態和rDNA同源性分析，將它們分為假單胞菌屬（sp）、無色桿菌屬（sp）、蒼白桿菌屬（sp）、青枯菌屬（sp）和溶桿菌屬（sp）。其中溶桿菌屬是該研究中新發現的具有百菌清降解能力的功能菌屬，該發現擴大了已知的百菌清降解菌的菌屬范圍。通過進一步鑒定及生理生化分析，確定了該降解菌的分類地位及理化特征。此外，該研究通過基因文庫法克隆到了發揮關鍵降解作用的水解酶基因，并發現該基因與轉座子原件相連，二者組成代謝轉座子，具有水平轉移的分子基礎。通過揭示降解基因在細菌間的漂移機制，初步明確了降解菌的功能基因及其分布規律。

土壤；農藥；細菌；基因克隆；水平漂移

0 引 言

百菌清（2, 4, 5, 6-四氯間苯二甲腈）是一種非內吸性廣譜殺菌劑，對多種作物真菌病害具有防治作用。該農藥性質穩定，殘效期長，具有明顯的毒性蓄積。受到百菌清污染的農業環境對人們的生活產生重大影響，該農藥對人和動物內分泌系統產生干擾作用，會造成人和動物雌性化、腺體病變和后代生命力退化，進而影響人和動物的生殖繁衍。因此，受百菌清污染土壤的修復技術也越來越受到人們的關注。農藥進入土壤后會對土壤微生態環境產生一定的影響[1-3]。研究證明，百菌清會對不同的土壤微生物生長造成相應的刺激或者抑制[4-7]。馮波等[8]在模擬土壤生態系統中研究了百菌清對土壤微生物數量和酶活性的影響。研究后發現，土壤經不同濃度百菌清處理后細菌、放線菌和真菌的生長受到不同程度的抑制作用。Sigler等[9]也對百菌清污染的土壤微生物群落進行分析，發現百菌清能夠抑制或者刺激不同細菌的生長，而真菌則全部被明顯抑制。在對土壤中生物酶的研究發現，百菌清對土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、纖維素分解酶均能夠產生一定的抑制作用[4,8,10]。因此，百菌清被廣泛證實能夠從多方面影響土壤微生態環境。

利用特種微生物降解土壤中的農藥殘留是農業土壤修復的重要手段之一。某些微生物可以將有機農藥污染物作為原料進行分解，從而達到降解的目的[11-12]。國內外在利用微生物降解農藥的研究中已經發現了大量的有機農藥降解菌，比如，人們分離到了眾多能夠分解對硫磷、甲基對硫磷及其他有機磷的生物降解菌[13-15]。然而，在百菌清的生物降解研究中，只有少數降解菌得到了研究[16-18]。并且，在研究百菌清生物降解菌的過程中，其降解功能基因的分離及分析等工作十分欠缺。在其他農藥降解菌的降解機理研究中發現，降解菌的生物多樣性與分子水平漂移機制相關。例如，研究發現降解有機磷基因的DNA中鳥嘌呤與胞嘧啶堿基對摩爾百分數含量與降解菌自身染色體DNA中的鳥嘌呤與胞嘧啶堿基對摩爾百分數含量明顯不同，降解基因如同一個外源侵入基因，插入到降解菌的DNA中，從而使其獲得了降解污染物的能力。此外，進化上相近的降解基因從發育關系較遠的微生物中被發現[19-21]，同樣也被認為是降解基因通過水平轉移獲得[22]。目前，已有很多研究從諸多方面揭示了降解基因水平漂移的現象[23]，并證明發生基因的水平漂移，是微生物獲得降解功能的重要途徑。并且，已有大量研究獲得了多種降解農藥的代謝轉座子。例如，Siddavattam等[24]發現有機磷降解基因存在于一個類轉座子結構中；張瑞福等[25]發現7株菌中甲基對硫磷基因都與轉座元件IS6100緊密相連；Hoffmann[26]發現2,4-D降解菌中降解基因的基因簇兩側有IS1071和IS1380兩個轉座元件，組成一個30 kb的定位于染色體上的轉座子結構。Top等[27-28]也研究了2,4-D降解質粒在不同降解菌中的轉移作用及其對土壤中2,4-D降解的影響。然而，百菌清降解基因的代謝轉座元件尚無報道。

因此，研究百菌清的生物降解，豐富降解菌庫，研究百菌清降解菌的多樣性，并從基因水平克隆和分析發揮關鍵降解作用的基因等，能夠為今后受百菌清污染土壤的生物修復技術奠定理論基礎。本文通過百菌清降解菌的分離和鑒定，研究了百菌清降解菌的多樣性，并對百菌清降解基因及其在各菌屬中的散布機制進行了初步研究，為受百菌清污染土壤的生物修復技術研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 降解百菌清菌株的分離

分別從百菌清生產車間、生產車間的綠化帶和連續施用百菌清的農田表層（0～15 cm）收集土壤樣品。分離所用的篩選培養基有基礎礦物鹽培養基（Minimal salt medium，MSM，普遍適用于各類微生物的篩選）、溶菌肉湯培養基（Lysogeny broth，LB，特別適用于細菌的篩選），馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar，PDA，特別適用于放線菌的篩選）及高氏一號培養基（特別適用于真菌的篩選）。MSM培養基每升包含1.0 g NH4NO3、0.5 g MgSO4·7H2O、0.5 g (NH4)2SO4、0.5 g KH2PO4、0.5 g NaCl和1.5 g K2HPO4，pH值7.0。LB培養基每升含10.0 g胰蛋白、5.0 g酵母提取物和10.0 g NaCl（pH值7.0）。PDA培養基包含200.0 g馬鈴薯和20.0 g蔗糖（pH值7.0）。高氏一號培養基中含1.0 g KNO3、0.01 g FeSO4·7H2O、0.5 g K2HPO4、0.5 g NaCl、20.0 g淀粉（pH值7.2）。固體培養基的配制通過添加2.0%瓊脂來制備。各種培養基在121℃高壓滅菌20 min，將百菌清儲備液過濾除菌并添加到各種篩選培養基中，以使最終濃度達到5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、80、100 mg/L。全部試劑均為分析純。

采用稀釋平板法分離百菌清降解菌：將1 g土壤放入9 mL無菌水中，并在30 ℃下混合20 min。然后靜置30 min后，取出1 mL土壤懸浮液，并稀釋至其原始濃度的10-3、10-4、10-5。然后將每種濃度的200L稀釋液涂在含有百菌清的初篩培養基MSM上。在30 ℃下孵育2～7 d后，根據菌落周圍的水解環選擇分離株。挑選產生透明圈的單個菌落，在篩選培養基上劃線多次，并在含有百菌清的篩選培養基上重新檢查純化的菌株。

1.2 百菌清降解菌株的鑒定與表征

根據伯杰氏細菌學手冊，結合菌株16S rDNA及生理生化特性對其進行鑒定。根據標準方法提取基因組DNA。通過使用2個通用引物P1和P6，從其基因組DNA擴增16S rRNA。其中，正向引物P1（59-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGCT-39）對應于大腸桿菌16S rRNA基因的8-37位置，反向引物P6（59-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-39）對應于大腸桿菌16S rRNA基因的1479-1506位置。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）條件為：94 ℃預變性5 min，變性（94 ℃，30 s）、退火（55 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，90 s）作為一個循環，共進行30個循環。最后在72 ℃穩定延伸10 min。PCR產物用凝膠提取試劑盒（TaKaRa Bio, Otsu, Japan）純化，并由中國北京的三博生物技術有限公司進行測序。應用NCBI中的BLAST進行DNA序列分析。從Genbank中調取親緣關系近的菌株的16S rDNA序列，用MEGA3.1進行序列比對，計算遺傳距離，建立系統發育樹。

用于菌種鑒定的生理生化實驗包括革蘭氏染色，氧化酶，接觸酶，最適pH值，耐鹽性試驗，硝酸還原試驗，酪蛋白水解試驗，產吲哚試驗，七葉苷水解試驗，尿素水解，吐溫80水解，淀粉水解，醌、極性脂、脂肪酸含量測定等，各生化反應的具體方法參照[29]。

1.3 染色體DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量和DNA的同源性測定

根據細菌分類鑒定標準，細菌染色體DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量及染色體DNA的同源性是將細菌鑒定到種的依據。鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量測定采用熱變性溫度（T值）法，所用儀器由Lambda Bio 20型紫外分光光度計、PTP-1 溫度控制儀、循環水浴和計算機組成。整個測定過程由UV Winlab 軟件控制。

1）T值的測定：將待測DNA樣品適當稀釋，使其吸光度為0.2～0.5。以K12菌株的DNA作參比，以消除試驗系統誤差。將稀釋后的DNA置于帶加熱裝置的紫外分光光度計中完成熱變性，根據變性過程中各溫度和對應的相對吸光度繪制成DNA變性曲線，熱變性曲線中點的溫度即為T值。

2）所測T值帶入特定公式即可算出細菌染色體DNA的鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量。使用公式鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量= 51.2+2.08 [T()?T()]計算，其中T()為待測菌的T值；T()為大腸桿菌K12的T值。

細菌染色體DNA同源性的測定采用DNA-DNA雜交法，經過DNA提取，剪切，變性，復性，從而測定兩株菌的DNA復性速率和同源性。將DNA置于溫度控制儀，并在100℃下變性10 min，變性結束后，將溫度控制儀的溫度設定為最適復性溫度[T=0.51(鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量)+ 47.0]。當變性DNA樣品的溫度迅速降至最適復性溫度，并穩定2 min后，開始復性反應，一般進行20 min。計算機可記錄260 nm處吸光值隨時間變化的復性反應曲線，該曲線的斜率即為DNA 樣品的復性速率（通常用表示，單位為每分鐘吸光值的減少值）。DNA同源性（，%）根據公式計算：

=[4V?(V+V]/[2(V?V1/2]×100 （1）

式中V表示樣品A的自身復性速率，V表示樣品B的自身復性速率，V表示樣品a與b等量混合后的復性速率。

1.4 基因文庫構建及功能基因篩選

提取溶桿菌RB-38的基因組DNA，取4g DNA，加入2L稀釋至 0.03 U/L的Sau3AI酶液，37℃消化，反應35 min，瓊脂糖電泳，回收4-8 kb片段。由于Sau3A I與BamH I為同尾酶，所以采用內切酶BamH I對載體pUC19進行酶切，并用堿性磷酸酶（CIAP）處理。將酶切片段與酶切的pUC19載體連接，連接體系為10L，載體0.5L，外源8.2L，10×buffer 1L，連接酶0.3L，16 ℃過夜連接，然后取連接產物1L轉化大腸桿菌DH10B，電極槽為1 mm，電壓1 600 V。將基因文庫得到的轉化子在百菌清液體篩選培養基中連續培養三代，最終收集菌體點種于百菌清篩選固體培養基上，觀察透明圈產生情況，從而篩選具有百菌清降解功能的基因片段。

2 結果與討論

2.1 百菌清降解菌的分離與鑒定

不同微生物對百菌清的耐受程度是不一樣的，為了選擇合適的培養濃度，保證降解菌不被過高濃度的農藥抑制或殺死，在各篩選培養基中加入百菌清母液，制成農藥梯度培養基，并觀察結果，見表1。結果顯示細菌對百菌清的耐受性最強，其在加有100g/mL百菌清的LB細菌培養基上的仍能大量存活，而真菌在添加同樣濃度百菌清的高氏一號培養基上不生長。百菌清濃度超過60g/mL，用于分離真菌的高氏一號培養基上不出現菌落，而百菌清濃度低于40g/mL，用于分離細菌的LB平板上的菌落數過多，不利于后續操作。因此選擇百菌清終濃度為50g/mL的培養基進行后續的培養。

表1 含不同濃度百菌清的培養基上菌落個數

由于待篩選的土壤中微生物的類型未知，因此我們初始選用適宜各種微生物生長的微生物基礎培養基（基礎礦物鹽MSM培養基），加入50g/mL百菌清進行篩選。本試驗共分離純化出14株百菌清降解菌，它們在含有百菌清的MSM平板上均有明顯的透明圈產生，見圖1。由培養結果可以看出，大部分篩選到的菌株可以在培養2 d之后就對百菌清產生明顯的降解作用，因此具有非常好的應用潛力。

注：篩選平板為加有50 μg?mL-1百菌清的基礎礦物鹽MSM培養基，箭頭指示在菌落周圍產生降解圈的菌，為篩選到的具有百菌清降解功能的菌株。

經革蘭氏染色，這些降解菌均為革蘭氏陰性菌，將這些分離到的菌株在含有百菌清的LB培養基上點種，驗證其百菌清降解功能（圖2），這14株菌均有明顯的降解百菌清的能力。顯微鏡下觀察菌體的形態各有不同（表2）且均無芽孢。

注：RB-No. 為各降解菌株在篩選過程中的編號，下同。

表2 百菌清降解菌的表型特征

擴增各降解菌株的16SrDNA，PCR產物純化回收后連接pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取在Amp-X-gal-IPTG上的白斑，cracking檢測后，送北京三博生物技術有限公司測序，測序結果在NCBI上用BLAST在線分析，結果顯示菌株RB-1、RB-4、RB-5、RB-6、RB-9、RB-12、RB-13、RB-23、RB-24的16S rDNA序列與假單胞菌屬（）的多株菌同源性達99%，菌株RB-16與無色菌屬（）的多株菌同源性達99%，菌株RB-28與蒼白桿菌屬（）多株菌同源性高達99%，菌株RB-29與青枯菌屬（）多株菌同源性達99%，菌株RB-31與RB-38與溶桿菌屬（）多株菌同源性達97%。通過分析比較將14株菌初步鑒定到屬的水平，如表3所示，并構建了它們之間16S rDNA序列同源性系統發育樹（圖3）。本研究表明百菌清降解菌種類廣泛，并以假單胞菌的數量和種類最多。在過去的研究中分離到的百菌清降解菌有氮單胞菌屬（），黃桿菌屬（），莫拉氏菌屬（），假單胞菌屬（），微球菌屬（）和蒼白桿菌屬（）等[16-18]。本試驗分離到的假單胞菌屬和蒼白桿菌屬為已知的具有百菌清降解功能的菌屬，而無色菌屬、青枯菌屬及溶桿菌屬是最新分離到的具有百菌清降解功能的菌株。這說明百菌清對土壤微生物種類的影響有可能還跟土壤類型、土壤性質、土壤中土著微生物的分布及豐度等因素有關。本試驗的篩選在前人研究的基礎上進一步豐富了百菌清降解菌庫，增加了無色菌屬、青枯菌屬及溶桿菌屬的降解菌株。此外，本試驗篩選到的溶桿菌屬的RB-31、RB-38與該屬內其他標準菌株的同源性較低，16S rDNA序列同源性只有97%，該值處于細菌新種鑒定的臨界值，說明其有可能成為該菌屬中的新種，因此選定這2株菌進行進一步的鑒定。

表3 百菌清降解菌的16SrDNA同源性比對結果

圖3 百菌清降解菌的16S rDNA系統發育樹

用MEGA3.1軟件分別計算RB-31、RB-38與溶桿菌屬17株標準菌株的16S rDNA的遺傳距離，構建系統進化樹（圖4），結果表明RB-31和RB-38位于同一個分支，且與標準菌株GH1-9T的進化關系最近，同源性分別為97.4%和97.2%。與其他標準菌株的同源性都低于97%。16S rDNA 序列同源性低于97%的菌一定不是同一個種，而具有97%或以上的相似性時，不能判定是哪個種，需要進一步DNA-DNA雜交確定，因此要確定RB-31和RB-38是不是溶桿菌屬的新種需要將其分別于GH1-9T進行DNA-DNA雜交。結果表明，RB-31與GH1-9T的DNA同源性為49.9%，RB-38與GH1-9T的DNA同源性為20.07%，RB-31與RB-38之間的DNA同源性超過70%，根據國際系統細菌學委員會規定，DNA同源性≥70%，雜交分子的熱解鏈溫度差≤5℃為細菌種的最低界限[30]。由于兩株菌與標準菌株GH1-9TDNA之間同源性均小于70%，而兩株菌之間DNA同源性超過70%，所以可以初步確定RB-31、RB-38代表溶桿菌屬的一個新種，為同一種內的不同菌株。

2.2 分離菌株的生理生化特性

由于生理生化特征往往是菌株本身某種代謝途徑或某種酶的特有表現，它在某種程度上反映了菌株的本質特征，因此本研究選取有代表性的菌株RB-38進行生化性質的測定，測定結果如表4。由前面結果已知，RB-38經過16S rDNA測序被初步鑒定為溶桿菌屬，其與該屬內其他標準菌株的同源性較低（97%左右），且與標準菌株GH1-9T的進化關系最近，同源性為97.2%。因此，將其與標準菌株GH1-9T進行生理生化特征的比較，結果表明RB-38與參比菌株GH1-9T生理生化特征相似，進一步證明RB-38是溶桿菌屬的菌株。然而同一屬中不同種之間的菌株性狀也有個別不同之處（表4）。其中，RB-38較GH1-9T耐受的溫度范圍較窄，但它的耐酸堿能力和耐鹽能力范圍均比GH1-9T廣，這一突出的酸堿適應性使得RB-38菌株在處理土壤及農藥污染方面具有了更大的應用潛質。

2.3 百菌清降解基因的克隆及分布

將基因文庫得到的一萬多株轉化子在百菌清液體篩選培養基中連續培養三代，最終收集菌體點種于百菌清篩選固體培養基上，觀察透明圈產生情況，從而篩選具有百菌清降解功能的基因片段。篩選到的具有百菌清降解功能的陽性轉化子編號838，提取陽性轉化子838的質粒pU838再次轉化大腸桿菌進行功能驗證，效果如圖5。

對陽性質粒pU838測序分析，結果表明其插入片段為3 493 bp，通過NCBI BlastX和軟件DNAMAN5.2中的ORF finder的分析表明，這段序列上有3個ORF，且轉錄方向一致。其中ORF1編碼轉座酶，ORF2編碼ATP結合蛋白，ORF3編碼水解脫鹵酶。

經與NCBI數據庫中的已知序列進行Blast比對，ORF3編碼的氨基酸序列與sp. CTN-3中水解脫鹵酶氨基酸序列一致性達99%。推測發揮百菌清降解功能的應該為此水解脫鹵酶（），推測百菌清在該酶的作用下苯環上的氯原子被水解，從而達到降解目的。

注：Escherichia coil ATCC 11775T為組外參照。

表4 菌株RB-38和標準菌株L.daejeonensis GH1-9T特征對比

注：GH1-9T為標準菌株 (standard strain)；+：陽性反應; －：陰性反應；W：微弱生長。

Note:GH1-9Tis standard strain; +: positive reaction; －: negative reaction; W: weak growth.

圖5 陽性轉化子質粒pU838在大腸桿菌中的功能驗證

針對ORF3的序列，設計特異引物，擴增結構基因，5′端引物P1（5′-AGAAAGCTTGACG ATGCCACTC-3′），引了I酶切位點，3′端引物P2 （5′-AAGTCTAGAGAGCAGGATCAAG GC-3′），引入了d III酶切位點，擴增產物與經過相同酶切后的pUC19連接，使得結構基因的起始密碼子在pUC19的啟動子下融合表達，驗證該閱讀框區域的功能，構建的載體命名為pUchd。結果如圖6所示：大腸桿菌coil DH10B轉化子產生了降解百菌清的透明圈，證明該開放閱讀框所編碼的水解脫鹵酶正是降解百菌清的功能酶，且該酶的表達不需要其他調控序列的存在。

進一步對3個開放閱讀框之間的核苷酸序列分析表明在ORF1和ORF2兩側存在20 bp的反向重復序列，其中左側重復序列（IRL）為5′- AAAACTGGGCCACTTCGCGC-3′，右側重復序列（IRR）為5′-GCGCGAAGTGGCTCAGATTT-3′。這4個元件（IRL、ORF1、ORF2、IRR）之間的組成和排列關系與已知的IS21家族簡單插入序列[31]具有典型的相似性，該家族插入元件均含有轉座酶編碼區、ATP-結合蛋白編碼區，并被2個簡單的反向重復序列所包圍。IS21家族中，研究的比較多的是IS100，IS100的結構特征于1994年就被Alexander等研究人員研究清楚，它全長1 954 bp，兩端各有28 bp的反向重復序列，一個1 023 bp的轉座酶編碼區和一個783 bp的istB樣的ATP-結合蛋白的編碼區[32]。因此本研究在此也得到了一個IS21家族的新成員，定名其為IS-，其全長1 926 bp，包含一個1 023 bp的轉座酶編碼區和一個657 bp的ATP-結合蛋白編碼區，兩端各有20 bp的反向重復序列。

注：2個箭頭均代表陽性轉化子E.coli DH101/pUchd。

為探索不同的百菌清降解菌中發揮降解作用的基因之間異同，本研究根據RB-38中已得到的序列設計特異性引物，引物在序列中的位置及關系如圖7所示：P1，P2用于擴增結構基因，838上游P1，P2用于擴增及上游序列。擴增結果如圖8所示，供試菌中均可擴增到與陽性對照大小完全相同的條帶，選取部分陽性條帶測序發現均為基因，然而并不是所有降解菌中都可以擴增到與基因相連的上游序列，擴增到上游序列的菌株有RB-4、RB-5、RB-13、RB-23、RB-24、RB-29，分別屬于假單胞菌屬和青枯菌屬。本研究分析發現，多株菌中百菌清降解酶基因均與簡單插入序列IS-相連，組成一個代謝轉座子，因此推測該轉座子是百菌清降解酶基因水平轉移的分子基礎，百菌清降解基因在IS-的作用下水平轉移，并出現在多株降解菌中。

圖7 特異性引物的相對位置及關系示意圖

注：數字對應于相應的菌株序號RB-(N); Marker; 1kb plus DNA ladder

目前分離到的有機物降解菌分類廣泛，包括假單胞菌屬（）、無色桿菌屬（）、產堿菌株（）、屎擬桿菌（）、吉氏擬桿菌（）、芽孢桿菌屬（）、棒狀桿菌屬（）、土壤桿菌屬（）、黃桿菌屬（）、短桿菌屬（）、枝動桿菌屬（）、黃孢原平革菌屬（）、曲霉屬（）、青霉屬（）、根霉屬（）、鐮刀菌屬（）、總狀共頭霉（）、諾卡氏菌屬（）、鏈霉屬（）等[11]。然而農藥降解基因之間的保守性卻很高，南京農業大學李順鵬實驗室分離到的7株甲基對硫磷降解菌分別為假單胞菌屬（）、無色桿菌屬（）、布魯氏菌（）和蒼白桿菌屬（），然而他們發揮降解作用的基因卻都是甲基對硫磷降解酶基因methyl parathion-degrading（gene）[12]。國內外分離到了很多對硫磷、甲基對硫磷及其他有機磷降解菌，他們分別屬于黃質菌屬（），假單胞菌屬（），無色桿菌屬（）[13-15]，然而這些菌都合成有機磷農藥水解酶基因organophosphorus pesticide degrading () gene，通過有機磷農藥水解酶發生降解作用[33]。其中假單胞菌GM和黃質桿菌sp. strain ATCC 27551中的基因完全相同，并與黃質桿菌中該基因的同源性為98%。有機污染環境中污染物降解菌的多樣性及降解基因的保守性，揭示了污染環境中微生物之間也許存在著降解基因的交流。

目前已經確定了3種基本的介導細菌間水平基因轉移的機制。細菌接合是依賴于細胞接觸的特定質粒或轉座子從供體到受體細胞轉移。自然轉化是在特定條件下細胞產生感受態并吸收自由DNA的過程。轉導是噬菌體介導的基因信息在供體和受體細胞的轉移。一些試驗現象和證據將研究者的思路引向了基因水平漂移的領域。首先人們發現進化上相近的降解基因或基因簇其宿主菌的地理位置上很遠[21]。而同一污染物不同菌株降解基因的系統進化關系與宿主菌16SrDNA的系統發育關系不一致。接著人們又發現降解有機污染物的基因與自轉移質粒或轉座子等移動基因元素相連：Siddavattam等[24]發現有機磷降解基因存在于一個類轉座子結構中，張瑞福等[25]發現7株菌中甲基對硫磷基因都與簡單插入序列IS6100緊密相連，同時降解基因或基因簇鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量與宿主菌的明顯不同，Hoffmann等[26]發現2,4-D降解菌P4a中降解基因的基因簇兩側有IS1071和IS1380兩個簡單插入序列，組成一個30 kb（Kilobase，千堿基）的定位于染色體上的轉座子結構。Top等[28]也研究了2,4-D降解質粒在不同降解菌中的轉移作用及其對土壤中2,4-D降解的影響。因此宿主菌降解基因的水平轉移是造成降解菌多樣性及其環境適應能力產生的很重要途徑。

3 結 論

本研究從百菌清生產車間，生產車間的綠化帶和連續施用百菌清的農田表層采集土樣，利用稀釋平板法，在含有百菌清的平板上分離到14株百菌清降解菌，經16S rDNA系統發育分析將所有菌株鑒定到假單胞菌屬（）、無色桿菌屬（）、蒼白桿菌屬（）、青枯菌屬（）和溶桿菌屬（），并經過進一步的鳥嘌呤和胞嘧啶堿基對的摩爾含量的測定、DNA-DNA雜交、化學鑒定及生理生化特征的鑒定最終將其中的2株鑒定到種的水平，為后續的工作奠定了基礎。同時構建了百菌清降解菌的基因組文庫，并從中克隆到了降解基因，初探了降解基因在污染環境中的多個菌株間水平轉移的分子基礎。本文的研究證明在百菌清污染的土壤中，微生物群落適應污染的分子機制之一是百菌清降解基因在細菌間的水平轉移，降解基因的轉移使得部分細菌獲得了降解百菌清的能力，這是環境中百菌清降解菌多樣性產生的原因。然而并不是所有的降解菌降解能力的產生都是通過這種方式得到的，部分降解菌中雖然也有同樣的百菌清降解基因，但它們并沒有處在轉座元件的下游，這些基因有可能是降解菌本身就有的。因此對于該降解基因的起源還有待于進一步的研究。

[1] Chu H, Gao G F, Ma Y, et al. Soil microbial biogeography in a changing world: Recent advances and future perspectives[J]. mSystems, 2020, 5(2): 1-12.

[2] Min H, Ye Y F, Chen Z Y, et al. Effects of butachlor on microbial populations and enzyme activities in paddy soil[J]. Journal of Environmental Sciences, 2001, 365: 581-595.

[3] Haque M N, Eom H J, Nam S E, et al. Chlorothalonil induces oxidative stress and reduces enzymatic activities of Na+/K+-ATPase and acetylcholinesterase in gill tissues of marine bivalves [J]. PLoS One. 2019, 14(4): 1-17.

[4] Ba?maga M, Wyszkowska J and Kucharski J. The influence of chlorothalonil on the activity of soil microorganisms and enzymes[J]. Ecotoxicology, 2018, 27(9): 1188-1202.

[5] Teng Y, Zhang M, Yang G, et al. Successive chlorothalonil applications inhibit soil nitrification and discrepantly affect abundances of functional genes in soil nitrogen cycling [J]. Environmental Science and Pollution Research International. 2017, 24(4): 3562-3571.

[6] Wu X, Cheng L, Cao Z, et al. Accumulation of chlorothalonil successively applied to soil and its effect on microbial activity in soil[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2012, 81: 65-69.

[7] Devi Y B, Thounaojam Meetei T, Kumari N. Impact of pesticides on soil microbial diversity and enzymes: A review[J]. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2018, 7(6): 952-958.

[8] 馮波，單敏，方華，等. 百菌清對土壤微生物數量和酶活性的影響[J]. 農業環境科學學報，2006(3)：674-677.

Feng Bo, Shan Min, Fang Hua, et al. Effects of chlorothalonil on soil microbial populations and enzyme activities[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2006(3): 674-677. (in Chinese with English abstract)

[9] Sigler W V, Turco R F. The impact of chlorothalonil application on soil bacterial and fungal populations as assessed by denaturing gradient gel electrophoresis[J]. Applied Soil Ecology, 2002, 21(2): 107-118.

[10] Yang X, Bennett B, Holz R C. Insights into the catalytic mechanism of a bacterial hydrolytic dehalogenase that degrades the fungicide chlorothalonil[J]. Journal of Biological Chemistry, 2019, 294(36): 13411-13420.

[11] 史秀珍. 百菌清降解菌的篩選及其降解特性研究[D]. 北京，中國農業科學院，2007.

Shi Xiuzhen. Isolation and Characterization of A Chlorothalonil-Degrading Bacterium[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2007. (in Chinese with English abstract)

[12] Zhang R, Cui Z, Zhang X, et al. Cloning of the organophosphorus pesticide hydrolase gene clusters of seven degradative bacteria isolated from a methyl parathion contaminated site and evidence of their horizontal gene transfer[J]. Biodegradation, 2006, 17(5): 465-472.

[13] Ogbo F C. Conversion of cassava wastes for biofertilizer production using phosphate solubilizing fungi[J]. Bioresource Technology, 2010, 101: 4120-4124.

[14] Patel D K, Murawala P, Archana G, et al. Repression of mineral phosphate solubilizing phenotype in the presence of weak organic acids in plant growth promoting fluorescent[J]. Bioresource Technology, 2011, 102: 3055-3061.

[15] Horne I, Sutherland T D, Rebecca L, et al. Identification of an(organophosphate degradation) gene in an agrobacterium isolate[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 3371-3376.

[16] Liang B, Wang G, Zhao Y, et al. Facilitation of bacterial adaptation to chlorothalonil-contaminated sites by horizontal transfer of the chlorothalonil hydrolytic dehalogenase gene[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(12): 4268-4272.

[17] Liang B, Li R, Jiang D, et al. Hydrolytic dechlorination of chlorothalonil by. CTN-11 isolated from a chlorothalonil-contaminated soil[J]. Current Microbiology, 2010, 61(3): 226-233.

[18] Atashgahi S, Liebensteiner M G, Janssen D B, et al. Microbial synthesis and transformation of inorganic and organic chlorine compounds[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 1-21.

[19] Whyte L G, Smits T H, Labbe M D, et al. Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems inQ15 and NRRLB-16531[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68: 5933-5942.

[20] Chu H Y, Sprouffske K, Wagner A. Assessing the benefits of horizontal gene transfer by laboratory evolution and genome sequencing[J]. BMC Evolutionary Biology, 2018, 18(1): 1-21.

[21] Nielsen T K, Rasmussen M, Demanèche S, et al. Evolution of sphingomonad gene clusters related to pesticide catabolism revealed by genome sequence and mobilomics ofMH[J]. Genome Biology and Evolution. 2017, 9(9): 2477-2490.

[22] Muturi E J, Donthu R K, Fields C J, et al. Effect of pesticides on microbial communities in container aquatic habitats [J]. Scientific Reports, 2017(7): 1-10.

[23] Imperato V, Portillo-Estrada M, McAmmond B M, et al. Genomic diversity of two hydrocarbon-degrading and plant growth-promotingspecies isolated from the oil field of Bóbrka (Poland) [J]. Genes, 2019, 10(6): 1-22.

[24] Siddavattam D, Khajamohiddin S, Manavathi B, et al. Transposon-like organization of the plasmid-borne organophosphate degradation (opd) gene cluster found insp[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69: 2533-2539.

[25] 張瑞福，戴青華，何健，等. 七株有機磷農藥降解菌的降解特性比較[J]. 中國環境科學，2004(5)：584-587.

Zhang Ruifu, Dai Qinghu, He Jian, et al. Comparison of degrading characteristics of seven organophosphate pesticide-degrading bacteria[J]. China Environmental Science, 2004(5): 584-587. (in Chinese with English abstract)

[26] Hoffmann D. A transposon encoding the complete 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid degradation pathway in the alkalitolerant strainP4a[J]. Microbiology, 2003, 149(9): 2545-2556.

[27] Top T, Courde L, McGowan C, et al. Phylogenetic analyses indicate independent recruitment of diverse gene cassettes during assemblage of the 2, 4-D catabolic pathway[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1999, 28: 373-382.

[28] Top E M, Springael D, Boon N. Catabolic mobile genetic elements and their potential use in bioaugmentation of polluted soils and waters[J]. Fems Microbiology Ecology, 2002, 42(2): 199-208.

[29] Jin H, Zhou Y, Liu H, et al. Paenibacillus jilunlii sp. nov., a nitrogen-fixing species isolated from the rhizosphere of Begonia semperflorens[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2011, 61: 1350-1355.

[30] Hinchliff C E, Smith S A, Allman J F, et al. Synthesis of phylogeny and taxonomy into a comprehensive tree of life[J]. Proceedings of the National Academy of Ences of the United States of America, 2015, 112(41): 12764-12769.

[31] Kim B J, Kim K, Kim B R, et al. Identification of ISMyo2, a novel insertion sequence element of IS21 family and its diagnostic potential for detection of Mycobacterium yongonense[J]. BMC Genomics, 2015, 16: 1-9.

[32] Lima-Mendez G, Oliveira A D, Ross K, et al. Toxin-antitoxin gene pairs found in Tn3 family transposons appear to be an integral part of the transposition module[J]. mBio, 2020, 11(2): 1-19.

[33] Trinder M, McDowell T W, Daisley B A, et al.reduces organophosphate pesticide absorption and toxicity to drosophila melanogaster[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2016, 82(20): 6204-6213.

Isolation, identification and functional gene analysis of chlorothalonil degrading bacteria

Ren Xiaojie1,2, He Zhuangzhuang1, Shan Xin1, Zhao Yubin3, Song Yuanda1, Zhao Xinhe1,3,4※

(1255000,; 2...,253000,;3...,276400,; 4.,401123,)

Chlorothalonil (2, 4, 5, 6-tetrachloroisophthalonitrile, TPN) was used as a broad-spectrum and non-systemic fungicide in China. However, this pesticide has been classified as a “probable human carcinogen” by the U.S. Environment Protection Agency (US EPA), due to its highly toxic to birds, fish, and aquatic invertebrates. Alternatively, bioremediation can be expected to degrade, even remove organic pollutants, with the promising application prospects. The diversity of in situ degrading bacteria in a polluted environment is critical to evaluate environmental toxicology, biodegradability, self-purification ability, and remediation potential of pollutants. In this study, an attempt was made to apply the biodegradation for the control of pollution. Firstly, the soil samples were collected from the long-term chlorothalonil-contaminated field. Fourteen chlorothalonil-degrading bacteria producing transparent halos were isolated using the plate culture and chlorothalonil-selective medium. Using the morphology and 16S rDNA homology, the bacteria were then classified to genussp.,sp.,sp.,sp. andsp.sp. The RB-31and RB-38were newly discovered strains with chlorothalonil degradation ability. Two strains were determined into species level as. And their specific physiological properties were studied. Secondly, the genomic library of strainRB-38 was successfully constructed in the pUC19 vector usingcoil DH10B as the host strain, where about 10 000 clones were obtained from selective culture. A 3 494 bp of desired fragment was isolated from the library using the functional ability to degrade chlorothalonil. In the desired fragment, three open reading frames (ORFs) were tentatively identified by ORF findings and BLAST alignment on NCBI. Specifically, ORF3 encoded a hydrolytic dehalogenase. Through subcloning of this reading frame, it was proved that the degradation function of chlorothalonil was catalyzed by the enzyme encoded in this region, and no other regulation regions were required for its expression. Two ORFs upstream ofgene showed that ORF1 encoded a transposase, whereas, ORF2 encoded on IstB-like ATP-binding protein. Two ORFs were flanked by 20 bp terminal inverted repeat sequences (IR). The complete sequence presented a perfect structural similarity to IS21 transposon family members that all contain transposase coding region, ATP-binding protein coding region, and flanked by inverted repeat sequences. A new member of this family was discovered and designated as IS. Thegene was closely associated with the insertion sequence, to construct a catabolic transposon. Finally, thegene and the upstream ISfragment were cloned and identified from several genomic DNA of chlorothalonil-degrading bacteria using a PCR strategy. It infers that the sequence element of ISwas the molecular basis for the horizontal transfer in thegenes, leading that the gene exchange can occur among these degrading species. This study can enrich the chlorothalonil-degrading bacterial library, and to clone hydrolytic enzyme genes that played a key role in degrading from the genetic level. A dispersing mechanism of degrading gene was also proposed among different genus bacteria. This preliminarily clarified the functional gene and its distribution in degrading bacteria.

soils; pesticides; bacteria; gene cloning; horizontal drift

任曉潔，賀壯壯，單昕，等. 百菌清降解菌的分離鑒定及功能基因分析[J]. 農業工程學報，2020，36(19)：209-216. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.19.024 http://www.tcsae.org

Ren Xiaojie, He Zhuangzhuang, Shan Xin, et al. Isolation, identification and functional gene analysis of chlorothalonil degrading bacteria[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(19): 209-216. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.19.024 http://www.tcsae.org

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.19.024

S482.2

A

1002-6819(2020)-19-0209-08

2020-05-30

2020-09-13

重慶市技術創新與應用發展重點項目（cstc2019jscx-gksbX0113）；國家博士后基金面上項目（2019M662362）；山東省自然科學基金博士項目（ZR2019BC099）；國家博士后基金面上項目（2019M650167）；山東省博士后創新項目（201902048）

任曉潔，博士，講師，主要從事發酵工程方面的研究。Email：renxiaojie2020@163.com

趙新河，博士，講師，主要從事發酵工程方面的研究。Email：zhaoxinhe@sdut.edu.cn