沉默牛磺酸上調(diào)基因1通過Wnt/CTNNB1信號通路提高胃癌細胞對順鉑和5-氟尿嘧啶的敏感性

關(guān)國欣，王冰，黃寶俊，趙丹懿

（1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院急腹癥外科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116027；3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽 110001）

胃癌在我國發(fā)病率僅次于肺癌，近年來胃癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升［1-2］。化學治療（簡稱化療）是治療腫瘤最有效的方法之一。中國臨床腫瘤學會對胃癌的一線治療方案為氟尿嘧啶和鉑類藥物的聯(lián)合治療，如順鉑（cisplatin，CDDP）聯(lián)合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。化療能明顯改善胃癌患者的預后，但化療耐藥嚴重限制了化療的臨床應用。因此，研究并發(fā)現(xiàn)提高化療敏感性的方法尤為重要。

許多非編碼RNA被證明參與腫瘤化療耐藥的發(fā)生和維持［3-4］。生長抑制特殊轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest specific transcript 5，GAS5）降低膀胱癌細胞對阿霉素的耐藥性［5］，尿路上皮癌相關(guān)1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）敲除抑制胃癌細胞對阿霉素的耐藥性［6］。牛磺酸上調(diào)基因1（taurine upregulated gene 1，TUG1）是在視網(wǎng)膜發(fā)育的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)并確定的［7］，其在膀胱癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中存在異常的表達和功能［8-11］。TUG1在胃癌中高表達，能作為癌基因發(fā)揮作用，可以作為胃癌潛在的預后因子［12］。但TUG1在胃癌化療耐藥中的作用尚不清楚。本研究擬探討TUG1與胃癌細胞對化療藥物CDDP和5-FU的敏感性的關(guān)系及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：76例胃癌及其癌旁正常組織均取自大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤科的標本庫。本研究獲得了大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。胃癌SGC7901細胞系以及多藥耐藥細胞系SGC7901/R由中國醫(yī)科大學腫瘤外科惠贈。本組患者包括男52例，女24例，年齡43～71歲，中位年齡為61.2歲。納入標準：所有患者均經(jīng)胃鏡活檢及病理檢測證實為胃癌，診斷前未接受其他治療，均選擇CDDP和5-FU聯(lián)合化療（新輔助化療或姑息化療）作為第一階段的治療方案。排除標準：患者病理資料不完整，或者患有其他疾病，包括其他腫瘤。所有患者接受2～4個療程的聯(lián)合化療，通過影像學檢查（增強CT）和胃鏡檢查來判斷治療效果。根據(jù)瘤體大小變化等評價治療效果，將患者分為化療敏感組（47例）和化療不敏感組（29例）。

1.1.2 主要試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自北京全式金公司；Trizol和Lipofectamine 3000購自美國賽默飛公司；SYBR RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；Smart Silencer-TUG1（ss-TUG1）及陰性對照（ss-NC）購自廣州銳博生物公司；增強型CCK8試劑盒購自上海碧云天公司；CDDP和5-FU購自美國Sigma-aldrich公司；pE-CTNNB1質(zhì)粒及空質(zhì)粒（pENC）購自上海吉瑪公司；TOP Flash和FOP Flash熒光素酶報告質(zhì)粒購自長沙優(yōu)寶公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京威格拉斯公司；CTNNB1和GAPDH抗體購自云克隆公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：SGC7901和SGC7901/R細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2。將5×104SGC7901/R細胞接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h。應用Lipofectamine 3000按照說明書操作，將Smart Silencer和（或）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/R細胞，培養(yǎng)5～6 h，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實時定量PCR：從組織或細胞標本中提取總RNA，檢測RNA的純度和完整性。以GAPDH為內(nèi)參基因，應用SYBR RT-PCR試劑盒擴增TUG1基因。引物序列見表1。反應體系和反應條件參照說明書。應用比較CT值法對TUG1的表達量進行相對定量分析。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers used in the current study

1.2.3 藥物敏感性檢測：分別用CDDP（0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL）或5-FU（1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL）處理SGC7901/R細胞。按照說明書使用增強型CCK8試劑盒檢測細胞活力。檢測450 nm處的吸光度，并計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.4 熒光素酶實驗：應用Lipofectamine 3000將熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/R細胞。采用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶為基線，腎素熒光素酶為內(nèi)控，計算兩者比值反映Wnt/CTNNB1信號通路的活性。

1.2.5 Western blotting：提取SGC7901/R細胞總蛋白，Bradford法進行蛋白定量。取30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用脫脂牛乳4 ℃封閉過夜，經(jīng)CTNNB1抗體雜交，二抗孵育，化學發(fā)光，凝膠成像儀獲取圖像。然后，利用Image J軟件對圖像中的譜帶進行檢測和分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。每組實驗重復5次，數(shù)據(jù)用表示。組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，2組獨立樣本均值比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TUG1的高表達與化療敏感性相關(guān)

胃癌組織表達檢測發(fā)現(xiàn)，TUG1在不敏感組胃癌組織中的的表達明顯高于其在敏感組中的表達（圖1A，P＜0.05）。

藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，SGC7901和SGC7901/R細胞CDDP的IC50分別為（1.83±0.23）μg/mL和（9.17±0.89）μg/mL，耐藥指數(shù)（resistance index，RI）為5.01（圖1B，P＜0.05）；SGC7901和SGC7901/R細胞5-FU的IC50分別為（5.23±0.48）μg/mL和（30.62±2.78）μg/mL，RI為5.85（圖1C，P＜0.05）。SGC7901/R細胞對CDDP和5-FU的敏感性更低，耐藥率更高。與組織表達檢測結(jié)果相似，TUG1在多藥耐藥的SGC7901/R細胞中的表達高于其在親本的SGC7901細胞中的表達（圖1D，P＜0.05）。

2.2 TUG1沉默增強SGC7901/R細胞對CDDP和5-FU的敏感性

圖1 TUG1的高表達與胃癌患者的化療不敏感相關(guān)Fig.1 High TUG1 expression is related to chemotherapy insensitivity in GC

將ss-TUG1轉(zhuǎn)染入SGC7901/R細胞可以顯著降低TUG1的表達（圖2A，P＜0.05）。藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，ss-NC組SGC7901/R細胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（8.81±0.62）μg/mL和（31.02±2.64）μg/mL，而TUG1沉默組SGC7901/R細胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（3.57±0.41）μg/mL和（8.42±0.93）μg/mL。TUG1的沉默能提高SGC7901/R細胞對CDDP和5-FU的敏感性。

2.3 TUG1沉默失活SGC7901/R細胞中的Wnt/CTNNB1信號通路

在腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中對450例胃癌樣本進行共表達分析，結(jié)果顯示，TUG1與CTNNB1呈顯著正相關(guān)（圖3A，r=0.324 9，P＜0.05）。其次，TUG1沉默抑制了SGC7901/R細胞中的螢火蟲熒光素酶/腎素熒光素酶熒光比值，意味著Wnt/CTNNB1信號通路的活性降低（圖3B，P＜0.05）。此外，TUG1沉默抑制SGC7901/R細胞CTNNB1蛋白的表達（圖3C，P＜0.05）。因此，TUG1沉默能夠失活SGC7901/R細胞中的Wnt/CTNNB1信號通路。

2.4 Wnt/CTNNB1信號通路介導TUG1對SGC7901/R細胞化療敏感性的調(diào)節(jié)

與ss-TUG1+pE-NC組SGC7901/R細胞相比，ss-TUG1+pE-CTNNB1組SGC7901/R細胞的螢火蟲熒光素酶/腎素熒光素酶熒光比值和CTNNB1蛋白表達均顯著升高（圖4A、4B，P＜0.05）。CTNNB1過表達能夠激活由于TUG1沉默而失活的Wnt/CTNNB1信號通路。ss-TUG1+pE-NC組SGC7901/R細胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（3.44±0.45）μg/mL和（8.21±0.87）μg/mL，ss-TUG1+pE-CTNNB1組SGC7901/R細胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（7.26±0.86）μg/mL和（24.63±2.69）μg/mL（圖4C、4D，P＜0.05）。ss-TUG1+pE-CTNNB1組SGC7901/R細胞中CDDP和5-FU敏感性明顯低于ss-TUG1+pE-NC組SGC7901/R細胞。Wnt/CTNNB1信號通路的激活逆轉(zhuǎn)了TUG1沉默對SGC7901/R細胞化療敏感性的促進作用。

圖2 TUG1沉默增強SGC7901/R細胞對CDDP和5-FU的敏感性Fig.2 TUG1 silencing enhances the sensitivity of SGC7901/R cells to CDDP and 5-FU

圖3 TUG1沉默失活SGC7901/R細胞中的Wnt/CTNNB1信號通路Fig.3 TUG1 silencing inactivates the Wnt/CTNNB1 signaling pathway in SGC7901/R cells

3 討論

越來越多的研究表明，非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要而復雜的作用。其中，lncRNAs因其數(shù)量眾多、功能和機制復雜等特點，引起了研究者的廣泛關(guān)注。lncRNAs被證明參與了腫瘤細胞的幾乎所有生物學行為，包括化療敏感性［13-15］。例如，神經(jīng)母細胞瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1）可以通過miR21/SOCS6途徑抑制膀胱癌細胞的惡性表型［16］，核富集豐富轉(zhuǎn)錄物1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）作為癌基因促進胃癌細胞的惡性生物學行為和阿霉素抗性［17］。

在本研究中，TUG1在化療耐藥的胃癌組織和細胞系中表達上調(diào)，TUG1沉默能夠提高SGC7901/R細胞對CDDP和5-FU的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)證實了TUG1參與了胃癌化療耐藥的形成，但其機制尚不清楚。

生物信息學分析為研究TUG1在胃癌化療耐藥中的機制指明了方向。基于TCGA數(shù)據(jù)庫的共表達分析證實TUG1與CTNNB1呈顯著正相關(guān)，而CTNNB1是Wnt/CTNNB1信號通路的關(guān)鍵分子。此外，TUG1沉默能夠失活SGC7901/R細胞中的Wnt/CTNNB1信號通路。Wnt/CTNNB1信號通路是一種經(jīng)典的、被廣泛研究的細胞內(nèi)信號通路，參與多種細胞生物學功能和行為的調(diào)控［18-19］。研究［20-21］表明Wnt/CTNNB1信號通路在多種腫瘤（包括胃癌）化療耐藥的發(fā)生和維持中起重要作用。MA等［22］報道TUG1沉默能夠失活肝細胞癌中的Wnt/CTNNB1信號通路。

圖4 Wnt/CTNNB1信號通路介導TUG1對SGC7901/R細胞化療敏感性的調(diào)節(jié)Fig.4 Wnt/CTNNB1 signaling pathway mediates the regulation of TUG1 in chemotherapy sensitivity in SGC7901/R cells

據(jù)此推測TUG1能夠通過Wnt/CTNNB1信號通路參與調(diào)控胃癌的化療耐藥。為了驗證這一假設(shè)，進行了一系列的拯救實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt/CTNNB1信號通路的激活逆轉(zhuǎn)了TUG1沉默對胃癌細胞化療敏感性的促進作用，即Wnt/CTNNB1信號通路介導了TUG1對SGC7901/R細胞化療敏感性的調(diào)節(jié)。然而，TUG1調(diào)控Wnt/CTNNB1信號通路的機制尚不清楚。

綜上所述，TUG1與胃癌患者對CDDP和5-FU的化療不敏感有關(guān)，TUG1沉默通過Wnt/CTNNB1信號通路促進胃癌的化療敏感性。本研究結(jié)論有助于闡明胃癌的化療耐藥機制，同時為胃癌的生物治療提供了新的靶點。