泛素特異性蛋白酶22與原發性中樞神經系統淋巴瘤預后的關系

鄭杰，劉英麗，康進生，崔雪花，桑琳霞，李文玲

（1.河北醫科大學第二醫院神經外科，石家莊 050000；2.河北醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室，石家莊 050017；3.河北省人民醫院神經外二科，石家莊 050051）

原發性中樞神經系統淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）臨床較少見，但近年其發病率呈增高趨勢且預后不佳［1-3］。絕大多數PCNSL屬于彌漫性大B細胞淋巴瘤，好發部位包括基底節區、胼胝體、額葉或腦室周圍結構，也可發生于眼部、腦膜和脊髓。到目前為止，其發病機制仍不十分清楚，多發生于免疫功能缺陷人群［4］。有研究［5］認為，一些遺傳因素可能作為其發病和預后的標志物。泛素特異性蛋白酶22（ubiquitin-specific protease 22，USP22）是一種新的腫瘤標志基因［6-7］，是新發現的一種人類去泛素酶，可表達于早期胚胎以及成人的各種組織中［8］。USP22是hSAGA的重要組成部分，通過對組蛋白H2A和H2B的去泛素化調控下游基因轉錄，而這些下游基因與腫瘤發生密切相關［6，9-12］。USP22的表達水平可以預測許多腫瘤的不良預后和治療失敗，如鼻咽癌、肝癌、胃癌等［13］。目前，USP22與PCNSL的關系還不清楚。因此，本研究主要探討了USP22在PCNSL預后中的作用，為今后的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 病例收集

收集2010年1月至2016年1月于河北省人民醫院神經外二科就診、術后病理證實并進行放化療的48例PCNSL患者的腦組織標本（PCNSL組織），同時收集27例腦挫裂傷患者挫傷灶腦組織標本（挫傷灶腦組織），所有組織均在手術過程中收集并及時放于液氮中保存。本研究所有患者均簽署知情同意書，并通過倫理委員會審核。

1.2 RNA提取和實時定量PCR檢測USP22 mRNA表達

采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法檢測USP22基因在48例PCNSL組織和27例挫傷灶腦組織中的表達情況。采用Trizol（美國Invitrogen公司）提取腦組織中的總RNA，并用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific）進行反轉錄。然后用Trans Start Top Green qPCR SuperMix［天根生化科技（北京）有限公司］試劑盒進行實時定量PCR。USP22引物：正向5’-TCAC CTCGAACTGCACCATA-3’，反 向5’-GAAGAAGTCCC GCAGAAGTG-3’。每個反應的終體積為20 μL，包括1 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，10 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix，8 μL水。擴增循環參數：94 ℃ 5 min；94 ℃ 5 s，56 ℃15 s，72 ℃ 10 s，共40個循環。

1.3 Western blotting檢測USP22蛋白表達

用凍存的PCNSL組織和挫傷灶腦組織提取總蛋白，并用Western blotting檢測不同組織中USP22蛋白的表達情況。首先用SDS-PAGE分離總蛋白，將其轉移至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后用抗USP22抗體（1∶500，美國Abcam公司）4 ℃過夜孵育，用0.1%TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min；加入倍稀釋的抗兔熒光抗體（1∶10 000，美國Abcam公司），避光室溫孵育1 h，0.1% TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min。應用Odyssey V3.0軟件對Western blotting條帶進行定量分析。

1.4 治療與隨訪

PCNSL患者術前均行頭MRI（平掃+強化）檢查，明確病灶部位、數量和大小后行立體定向穿刺活檢，病理證實為PCNSL。治療方案采用化療+放療。所有患者跟蹤隨訪至2018年1月。所有相關信息均來自河北省人民醫院神經外二科的病歷記錄，記錄患者總生存期，進行預后分析。

1.5 統計學分析

應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗進行比較。計量資料以或M（P25～P75）表示，采用t檢驗進行比較。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，采用Cox模型進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床和病理特征

本研究共納入48例PCNSL患者，中位年齡52.4（28～74）歲。其中30例（62.5%）主要表現為頭痛、頭暈等顱高壓癥狀，12例（25.0%）表現為肢體乏力、輕偏癱等局灶性神經功能缺失癥狀，6例（12.5%）表現為情感障礙、記憶力減退等精神癥狀。按照不同年齡、不同性別等臨床特征進行比較（表1），結果顯示，USP22蛋白表達水平與腫瘤大小及病灶數量有關（P＜0.05），腫瘤直徑越大、病灶數量越多，則USP22蛋白表達水平越高，而與年齡、性別等其他臨床特征無關（P＞0.05）。

2.2 治療和預后

PCNSL患者化療方案為大劑量甲氨蝶呤單藥化療，中位療程6（3～8）個療程。放療采用全腦放療或局部放療，中位放療劑量30（19～60）Gy。平均生存期為（26.27±12.39）個月。

2.3 PCNSL組織與正常腦組織中USP22 mRNA和蛋白的表達差異

采用qRT-PCR檢測PCNSL組織和挫傷灶腦組織標本中USP22mRNA的表達情況。結果顯示，PCNSL組織USP22mRNA的表達水平明顯高于挫傷灶腦組織（P＜0.001，圖1A），說明USP22作為腫瘤標志物的重要性；PCNSL組織USP22蛋白表達水平也明顯高于挫傷灶腦組織（圖1B）。

2.4 USP22表達對PCNSL預后的影響

以各標本中USP22蛋白的表達水平平均值為標準，根據USP22蛋白的表達水平將PCNSL分為低表達組（蛋白表達水平低于平均值，n=22）和高表達組（蛋白表達水平高于平均值，n=26）。Kaplan-Meier分析結果（圖2）顯示，在經過放化療后的PCNSL患者中，USP22表達水平越高，預后越差。Cox回歸分析（表2）顯示，USP22蛋白表達水平是PCNSL的一個獨立預后影響因素，USP22表達水平越高，預后越差（P＜0.05）；同時，病灶數量也是一個獨立影響預后的因素，病灶數量越多，預后越差（P＜0.05）。這些結果表明，USP22的高表達與PCNSL的發展進程和預后密切相關。

表1 USP22蛋白表達水平與PCNSL患者臨床特征的關系Tab.1 USP22 protein expression and the clinical characteristics of patients with PCNSL

圖1 USP22在PCNSL組織和挫傷灶腦組織中的表達情況Fig.1 USP22 expression in PCNSL tissues and brain tissues with contusion

圖2 PCNSL患者的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier estimate of patients with PCNSL

3 討論

PCNSL是一種發病率較低但預后較差的中樞神經系統腫瘤［14-15］。目前，一些臨床和病理指標仍不能很好的預測其預后。因此，急需尋找新的診斷標志物以便制定治療策略、預測治療效果。近年來人們更多的關注腫瘤表觀遺傳學，尤其是基因標志物對腫瘤治療效果和預后的評估作用［16］。泛素-蛋白酶體系統主要參與介導細胞內蛋白質降解代謝、細胞周期和轉錄調控、DNA損傷修復等多種細胞過程［16］。其泛素化過程具有可逆性，即通過去泛素化酶對底物蛋白的去泛素化調控蛋白質的壽命或功能。因此，去泛素化酶在維持細胞正常功能和某些病理過程中發揮重要作用。去泛素化酶分為6大類，泛素特異性蛋白酶家族（ubiquitin-specific protease，USP）是目前去泛素化酶中成員最多、結構最具多樣性的一類［16］，其中以USP22最為重要。正常生理狀態下，USP22廣泛表達于人體各種不同組織，其中以骨骼肌和心臟表達最多，腦、腎臟和胰腺表達中等，肺和肝臟表達最少。目前研究［17-18］已經證實，USP22是一個重要的腫瘤標志基因，在許多腫瘤的發展進程中起著至關重要的作用，可以作為一些腫瘤的診斷和預后標志物。但是其與PCNSL的關系還鮮有報道。因此，本研究的主要目的是探討USP22在PCNSL的發展和預后中的作用，為今后的治療提供新的靶點。

表2 影響PCNSL患者生存的Cox多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of the survival of patients with PCNSL using Cox model

本研究共選擇了48例PCNSL患者作為病例組，利用立體定向技術獲取PCNSL組織標本，采用qRT-PCR檢測USP22mRNA的表達情況，結果顯示，PCNSL組織標本中USP22mRNA的表達水平高于挫傷灶腦組織。同時采用Western blotting分析USP22蛋白的表達情況，結果顯示，PCNSL組織USP22蛋白的表達水平高于挫傷灶腦組織，與USP22mRNA的結果一致。而且USP22蛋白的高表達與病灶數量增多呈正相關。既往研究［17-18］表明，USP22可通過調節Survivin影響細胞凋亡，進而影響腫瘤的發生、發展和預后；可通過上調叉頭框蛋白M1表達，促進β連環蛋白核轉位，促使G1/S期細胞增多；通過調節轉錄因子，促進腫瘤細胞增殖和轉移；通過調控細胞內STAT、TGF-β等多條信號轉導通路參與腫瘤的發生過程。結合本研究結果，表明USP22在PCNSL的發生、發展過程中起到促進作用，其作用機制可能與文獻報道相符。

為了進一步驗證USP22蛋白表達與PCNSL預后的關系，本研究采用Kaplan-Meier分析驗證USP22蛋白的高表達對放化療后患者預后的影響。結果證實，USP22蛋白表達水平越高，患者預后越差。同時采用Cox回歸模型進一步分析了影響PCNSL預后的因素，結果證實，USP22是一個獨立影響PCNSL預后的因素。這些結果表明，USP22蛋白的高表達可以影響PCNSL的進程，降低放化療治療效果，造成患者預后不良，這與其在其他腫瘤中的作用一致。

總之，本研究證實了USP22可以促進PCNSL的進程，其高表達可引起患者預后不良，因此USP22可作為今后PCNSL的治療靶點和預后標志物，但其功能和分子機制仍不十分清楚，需要進一步的研究來確定其具體的調控機制，為PCNSL的診斷和治療提供新的靶點和方向。