乳腺癌患者來源腫瘤異種移植模型的臨床應用與進展△

孫衛欣，薛婷，尹光浩#

1吉林省前衛醫院藥學部，長春130012

2吉林大學第二醫院乳腺外科，長春1300410

1 乳腺癌的治療現狀

全球腫瘤流行病統計數據顯示，乳腺癌已經成為女性發病率最高的惡性腫瘤[1]。近年來，亞洲地區乳腺癌的發病率逐年升高，且呈年輕化趨勢。隨著醫療技術的不斷發展及抗腫瘤藥物的研究與開發，乳腺癌患者的生存情況得到顯著改善。但是，TNM 分期為Ⅰ～Ⅲ期的原發乳腺癌患者的10年復發率仍約為5.8%，其中，大多數患者的復發與原發性或繼發性耐藥機制的產生有關?？梢姡橄侔┗颊邔鼓[瘤藥物的耐藥問題嚴重制約著其治療效果。

乳腺癌的異質性主要表現在組織學、基因組學、蛋白質組學及治療效果等方面，而此種異質性尚不能通過組織病理學、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結受累數目及腫瘤標志物等臨床相關參數得到精確的評估。乳腺癌在不同個體中呈高度異質性[2]，而很多新技術、新療法在Ⅲ期臨床試驗階段又到達了瓶頸期，因此，如何建立更加有效的臨床前模型并推動抗腫瘤藥物的研發成為了現階段乳腺癌領域亟待解決的問題。

目前，普遍提倡通過對基因組醫學和藥物基因組學的研究為患有相同疾病的不同患者亞群個體化治療方案的制訂提供更加可靠的理論依據?；颊邅碓茨[瘤異種移植（patient-derived xenograft，PDX）模型能夠保持其原始樣本的分子異質性，為研究出更加有療效的抗腫瘤藥物提供了強有力的工具。PDX 的潛在應用非常廣泛，包括新的治療靶點的識別、最佳治療方案的制訂、化療效果的分析和藥物組合的臨床前評估，以及生物標志物的識別和新的耐藥機制的發現[3]。對這些特征的探索有利于對惡性腫瘤進行更深入的研究，使前期實驗更加契合臨床真實事件[4]。

2 乳腺癌體外模型的建立與優化

幾十年來，生物學家一直采用腫瘤單細胞層體外培養的方式從培養的腫瘤細胞中提取小鼠異種移植物進行生物學特征的研究[5]。然而，數據表明，腫瘤細胞株的生長與其實際來源腫瘤的增殖方式存在很大差異。在細胞傳代的過程中，由于應用大量培養基進行培養，導致細胞內遺傳物質改變和細胞系污染等事件的情況時有發生[6]。此外，連續細胞系在代數增加的同時，在細胞表型、細胞功能以及對疾病模型的反應機制等方面出現了與原代細胞完全不同的情況。因此，細胞系是無法如實反映符合人類腫瘤微環境的變化的，特別是在某些通路和疾病功能的研究中，細胞系實驗的缺點逐漸暴露。細胞培養模型中基因表達的模式越來越單一，表明腫瘤一旦從患者體內被取出，脫離了正常的生長環境，轉而在實驗室中培養，其異質性就會消失[2]。在細胞培養的過程中，選擇性壓力使分化程度最低的細胞得以生長，因此，經過長時間的培養，大多數細胞系已適應了體外環境，產生了與人類不同的異質性，在遺傳學和表型上與其起源細胞均大有不同[7]。為了更好地構建人體腫瘤原本的生長環境，盡可能地保留腫瘤自身的特征，人們提出了PDX 模型這一概念。其實，早期PDX 模型的雛形是通過輻射或激素等干預方法從大鼠中獲得的人類表皮樣癌。此外，也可通過將人結直腸癌組織移植至裸鼠身上，利用動物模型研究惡性腫瘤。1987 年，加州大學醫學中心在裸鼠中建立了黑色素瘤的異種移植動物模型，改善了移植率低的問題。這些移植成功的模型均為抗腫瘤藥物療效的預測、靶向藥物的尋找奠定了基礎[8]。

目前，廣泛應用于乳腺癌領域的細胞工具包括人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-435S 和MDA-MB-453 等[9-11]。但是，由于這些細胞系的無限傳代與培養，其表面的糖蛋白減少，細胞之間的黏著性降低，一些基因無法正常表達。

3 乳腺癌體內模型

3.1 用于一線基礎研究的動物模型

3.1.1 T 淋巴細胞功能缺陷鼠 目前，BALB/c-nu

裸鼠已成為醫學研究領域不可或缺的的實驗動物模型。此小鼠無胸腺，為免疫缺陷鼠，不能產生T細胞。隨著年齡的增長，皮膚角質層變薄，頭頸部皮膚失去彈性，生長發育速度逐漸變慢，雖然B 淋巴細胞正常，但其免疫功能欠佳。裸鼠自發腫瘤現象罕見，抵抗力差，容易患病毒性肝炎和肺炎。

3.1.2 B 淋巴細胞功能缺陷鼠 重癥聯合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠是自發性的SCID 突變鼠系，T 細胞和B 細胞的發育和成熟受到阻礙。但是，SCID 小鼠有正常的NK細胞、巨噬細胞和粒細胞，其外觀與正常小鼠相同。但是，SCID小鼠免疫器官的重量未達到正常小鼠的30%。SCID 小鼠是PDX 模型的良好宿主[12]。少數SCID 小鼠的免疫功能在青年期可出現一定程度的恢復，這與小鼠的年齡、品系、飼養環境有關。SCID 小鼠易被感染，在高度潔凈的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環境下可存活1 年以上。SCID 小鼠自發性T 細胞淋巴瘤的發病率為15%左右，起源于胸腺，并可發生多部位轉移。

非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，NODSCID）小鼠是基于SCID 小鼠而研發出的免疫缺陷鼠[13]。與SCID 鼠相比，其NK 細胞的活性較低，免疫恢復的概率更低。SCID 突變基因的純合影響了T、B 淋巴細胞的正常發育。NOD-SCID 小鼠既存在先天免疫缺陷，又缺乏T、B 淋巴細胞，適用于各種腫瘤組織的移植。但是，NOD-SCID 小鼠更易發生淋巴瘤，且存活時間較短。

3.1.3 重度免疫缺陷鼠 近年來，在NOD-SCID 小鼠的背景下敲除白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）受體基因得到了NSG 小鼠。與其他免疫缺陷鼠相比，NSG 小鼠的移植成功率最高，能夠接受更多的移植物。值得注意的是，NSG 小鼠還能實現人類免疫系統的重建，植入人類造血干細胞后，NSG 小鼠的外周淋巴組織可以產生人類T 細胞。

3.1.4 B、T 淋巴細胞及自然殺傷細胞功能缺陷鼠Beige（bg）小鼠是細胞活性缺陷的突變系小鼠，該品系為SCID 和Beige 基因突變小鼠。該小鼠的特點為自然殺傷細胞發育和功能缺陷，巨噬細胞活性降低，免疫抗腫瘤殺傷作用出現的時間較遲，細胞毒性T 細胞功能缺乏，體液免疫減弱。該品系適用于免疫學研究，尤其是各種致病因子的應用，但需要達到SPF 級小鼠培養的環境要求。

3.2 PDX 建立方法

3.2.1 組織移植 建立PDX 模型的常用方法是提取患者的腫瘤組織并移植在免疫缺陷鼠皮下。首先通過手術或活檢收集患者的原發腫瘤組織，將其用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次，然后將無菌培養皿置于冰上，于培養皿中切成﹤1 mm3大小的塊狀。麻醉免疫缺陷小鼠，使用眼科剪剪開約0.5 cm 切口，使用器械將筋膜與皮膚分開，然后將腫瘤組織放入小鼠乳腺相應的部位。這些處于移植階段的小鼠稱為F1 小鼠。當腫瘤生長并達到直徑約1.5 cm 時，將F1 鼠的腫瘤組織移植到另一只免疫缺陷鼠上，方法同F1 移植過程，處于該擴增期的小鼠稱為F2 小鼠。觀察腫瘤生長情況，當腫瘤體積達到100～150 mm3時，腫瘤組織可用于下游應用[14]。

3.2.2 細胞懸液移植 細胞懸液移植指的是注射細胞懸液于移植部位，具體方法：將組織剪碎成大小為1～2 mm3的小塊，將組織研至勻漿；沖洗并收集細胞懸液，濾網過濾細胞，離心沉淀，充分沖洗細胞后，用注射器吸取帶有基質膠的腫瘤細胞，并注射入皮下，其他步驟同上[15]。

3.3 體內模型建立的影響因素

移植腫瘤時，腫瘤組織塊的大小與腫瘤細胞的成活率關系密切，組織塊過大會阻礙腫瘤細胞與生長環境的結合。同時，應確保腫瘤組織的活力，避免移植入無效的腫瘤組織[16]?；|膠可為腫瘤細胞起到提供營養、聚集細胞的作用[17]。因此，在移植過程中加入基質膠會提高移植的成功率[18]。

腫瘤細胞離體的時間對于移植的成功率亦具有重要影響。由于腫瘤組織離體后會處于缺血、缺氧的狀態，因此，會對組織和細胞的生長發育不利，進而影響PDX 模型移植的成功率。因此，將腫瘤細胞收集后種植到小鼠皮下的時間不宜過長，一般應在2～3 h 內完成，并且需要外科醫師與研究者密切配合。

4 PDX 的優勢與不足

4.1 優勢

經過長期的體外培養，傳統細胞系移植模型（cell-derived xenograft，CDX）的腫瘤細胞逐漸適應了外環境，喪失了異質性，獲得的實驗結果趨于同質化[19]。然而，PDX 模型中，移植的標本來自人體腫瘤組織，充分保留了腫瘤間質和細胞成分，使腫瘤生長的微環境更接近原發瘤；通過患者自身的腫瘤組織構建的PDX 模型能夠反映個體的差異，更接近患者的實際情況[20]，有助于研發出針對個體的抗腫瘤藥物和檢測出自身特有的生物標志物；收集的標本也可為今后的研究提供大量的參考。未經過體外培養的PDX 模型穩定地保留了原發瘤的遺傳特性、組織學和表型特征，實驗結果顯示臨床預見性更好[21-22]，通過腫瘤標志物評估腫瘤情況，可用于測試抗腫瘤藥物的敏感性和預測患者的預后，實現腫瘤的個體化治療。

4.2 不足

各種數據及分析均表明PDX 模型的建立比長期建立的細胞系和標準異種移植物更符合臨床惡性腫瘤的表型，但是，PDX 模型并未廣泛應用于實驗中，主要存在以下影響因素[23]。

成本是PDX 模型未廣泛應用于臨床的一個主要問題。為了得到有效的結果，每個樣本需要移植大量的受體鼠，同時，腫瘤移植物僅能在小鼠體內維持，與單純維持培養細胞株相比，其培養及傳代需要更潔凈的培養環境及專業的技能，大大增加了成本。另外，制模周期過長，一般需觀察3～6個月才能決定模型是否成功[24]。由于人和鼠為不同的物種，因此，物種間的差異依然會存在。小鼠的環境會逐漸取代原發腫瘤的生長環境。腫瘤組織在小鼠體內傳代過程中的一些不可控因素也可能導致個別基因的改變而無法準確反映患者的病情。

由于PDX 模型的構建需要免疫缺陷動物，而對免疫調節藥物或通過免疫功能激活的藥物研究就會限制此種模型的應用[25]。乳腺癌PDX 模型的成功率較低又是當前研究面臨的一個影響實驗進程的重要因素，為了提高PDX 模型的成功率，移植過程中需要注意以下問題：①腫瘤自身因素，與其他腫瘤相比，乳腺癌和前列腺癌PDX 模型建模更難。主要由于這兩種疾病的發生與激素水平有關。②實驗用鼠多為重度免疫缺陷小鼠。這些小鼠的免疫缺陷程度較高，可以保證相對較高的移植成功率，但也會為其他腫瘤的發生提供可能。③為了保證移植腫瘤的質量，需要有經驗的外科醫師判斷提取的是腫瘤細胞且無壞死組織。

5 小結與展望

近年來，關于PDX 模型應用于乳腺癌的研究越來越多，Ramani 等[26]通過應用三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）患者的PDX 模型對循環腫瘤細胞及其遠處轉移情況進行研究，結果顯示，PDX 腫瘤模型對于研究TNBC 具有重要意義。此外，Rosato 等[27]通過檢測人源化抗程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）單克隆抗體研究TNBC 患者PDX 模型的體內活性，結果顯示，抗PD-1 抗體可顯著抑制部分PDX 腫瘤株的生長，并提高患者的生存率，表明PDX 模型在乳腺癌藥物的篩選中起到重要的作用，且應用前景廣泛。

乳腺癌PDX 模型保存了原發腫瘤的分子特性、遺傳性和異質性，為檢測和比較不同抗腫瘤藥物治療效果提供了高效、可靠的工具，有望進一步推動乳腺癌臨床治療方案的優化與革新[28]。

PDX 模型優于傳統的腫瘤細胞系異種移植模型，主要由于其與親代腫瘤有更多的相似之處[29]。目前，PDX 模型作為惡性腫瘤研究的可靠臨床前模型越來越被研究者們接受[30]，其維持了供體腫瘤的生物學特性，具有良好的臨床預測性。就目前的情況及數據調查結果顯示，通過PDX 模型實現個體化治療還未達到實質性的進展，仍處于臨床驗證階段。因此，迫切需要更好、更具有臨床預測性的人類惡性腫瘤模型。有研究發現了另一種能反映人類惡性腫瘤的模型——人源腫瘤類器官模型（patient-derived organoid，PDO），研究者從人體中提取多能干細胞，通過短暫地低滲裂解紅細胞，計算細胞數量和生存能力。通過給予基質膠等進行極小的刺激，從而促進其分化，并任其自由生長。這些細胞會自動根據種類分開，并排列成特定的空間構型，經過幾個月的培養，長成類似于人體器官結構的“類器官”[31]。經腫瘤組織培養出的“類器官”未來能夠更好地反映腫瘤的特點，可用于藥物反應性試驗等研究。無論PDX 模型還是PDO 模型，都是通過改變動物模型的條件形成符合人類的腫瘤微環境，以對人類最小的損傷達到臨床最佳的效果。這些嘗試對乳腺癌新藥的研發及作用機制的研究均具有重要意義[32]，進一步推進了乳腺癌個體化治療的進程，并促進其研究結果向臨床轉化。