基于線粒體DNA D-Loop 區分析我國沿海厚殼貽貝群體遺傳結構

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程中心，浙江舟山 316022)

厚殼貽貝Mytilus coruscus 隸屬軟體動物門Mollusca、雙殼綱Bivalvia、貽貝目Mytioida、貽貝科Mytilidae、貽貝屬Mytilus[1]，主要分布于日本北海道海域、韓國濟州島海域、中國的渤海、黃海、東海以及臺灣海域，厚殼貽貝殼頂尖細，殼面常呈棕褐色。厚殼貽貝生活在低潮線以下鹽分高、海流大的淺海中，其垂直分布深度較深，達20 m 左右，以10 m 左右密度最大，幼貝分布較淺[2]。厚殼貽貝苗種人工繁育已經成功進行，其過程主要包括：親本貝在適宜水溫的條件下完成受精，受精卵開始進行分裂分化等過程，最后變態發育成稚貝，其胚胎發育為成體的全過程歷時約35 d[3]。厚殼貽貝與海洋中許多無脊椎動物相類似，發育中的幼蟲會自行選擇適宜生存的棲息地點并完成它的附著過程[4]。厚殼貽貝個體大、生長快，肉味鮮美、營養豐富，且具有滋補保健作用，在國內外市場深受歡迎，價格遠高于貽貝和紫貽貝，為出口創匯產品[5]。我國厚殼貽貝主要養殖區在浙江舟山，特別在嵊泗縣是最主要海水養殖品種，其養殖生產已有十余年歷史，目前每年養殖數量達50 億～60 億粒以上[6]。厚殼貽貝作為我國重要的水產養殖貝類品種之一，種質資源和野生遺傳結構的研究分析對提升種源的品質和養殖貝的質量具有一定的參考價值，也可幫助當地的漁業水產了解厚殼貽貝的野生資源情況，有效保護野生種質資源，提升厚殼貽貝養殖產量。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，簡稱mtDNA)相對于核DNA 具有結構簡單、母系遺傳、進化速率快、幾乎不發生重組、富含系統發育信號等特點，是作為種屬進化研究的良好標記[7]。其中，線粒體DNA DLoop 區序列由于不編碼蛋白質而不受自然選擇的影響，因而進化速率最快，積累了較多的突變，如堿基替換、插入、缺失，以及眾多的串聯重復序列等，所以在種群遺傳學分析中得到普遍應用[8-9]。

本研究對我國沿海6 個厚殼貽貝野生群體的mtDNA D-Loop序列進行PCR 擴增和測序，開展關于群體間遺傳變異和系統分化等方面研究，旨在為我國厚殼貽貝野生種質資源的合理開發和保護提供分子生物學依據，并為制定合理的育種方案提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA 提取

實驗所用的厚殼貽貝于2016 年3 月至12 月之間采集于青島(QD)、舟山(ZS)、玉環(YH)、臺山(TS)、平潭(PT)、廈門(XM)，每個地點隨機采樣活體解剖取閉殼肌(圖1、表1)，保存于無水乙醇中，用于DNA 提取。采用改良鹽析法提取基因組DNA[10]，并溶解于TE緩沖液中，瓊脂糖凝膠電泳檢驗其純度后-20 ℃保存備用。

圖1 我國沿海6 個地區野生厚殼貽貝樣本采樣地點Fig.1 Map showing six sampling locations of wild M.coruscus along the China Sea

表1 厚殼貽貝的樣品細節及核苷酸組成以及參數指數Tab.1 Sample details,nucleotide composition and parameter indices for M.coruscus

1.2 目的片段的擴增與測序

利用NCBI 數據庫下載厚殼貽貝線粒體全基因組數據(GenBank 登錄號：KJ577549)的D-Loop 序列全長，并使用Premer-primer6.0[11]設計引物，D-Loop-F：CGGTAGGAAGAAGTAGAGT；D-Loop-R：CTTGCTCACCAGGAACAT，引物合成由杭州擎科梓熙生物技術有限公司完成。PCR 反應體系為25 μL，包括：12.5 μL ExTaq (Takara)，1 μL 前后引物(濃度0.1 OD)，0.5 μL 模板DNA 以及10 μL 去離子水。PCR 擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，33 個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將PCR 產物置于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測產物質量，確認條帶大概長度。將符合目的片段長度的PCR 產物冷凍封存后，由杭州擎科梓熙生物技術有限公司對PCR 產物進行雙向測序，獲取產物序列信息。

1.3 數據處理與分析

通過ClustalX 2.0[12]對測序獲得的線粒體DNA D-Loop 區序列進行比對矯正，并對齊全部序列片段。為鑒定物種和所得片段的準確位置，使用NCBI 數據庫中在線BLAST 工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對所有片段進行在線比對。將比對矯正后的序列以FASTA 格式導入軟件MEGA 7.0[13]進行序列比對及變異分析，計算群體間的遺傳距離并使用鄰接法構建系統發育樹。使用軟件DnaSP 6.0[14]對所有數據根據其群體進行分組，并計算各類遺傳多樣性參數，如：單倍型個數(n)、變異位點、單倍型多樣性(h)和核苷酸多樣性(π)。使用軟件Arlequin 3.5[15]進行分子方差分析(AMOVA)、計算遺傳分化系數(FST)、基于Tajima’s D 與Fu’s Fs 模型下，對數據進行中性檢測。將所有單倍型在軟件MEGA7.0[13]中進行計算并構建系統發育樹。使用軟件Network5.1[16]基于中介鄰接法(median-joining method)構建各分子標記的單倍型網絡圖。

2 結果

2.1 群體內遺傳變異

在對129 個樣本D-Loop 區序列進行測序分析后，獲得了長度為1 113 bp 的片段，其中變異位點31個(表2)，序列組成顯示A、T、G、C 堿基含量分別為A：32.8%、T：31.4%、C：13.4%、G：22.4%，A+T 含量(64.2%)顯著高于G+T 含量(35.8%)，具有明顯的堿基組成偏倚性。共得35 個單倍型(GenBank 登錄號：MG888576-MG888610)(表3)。單倍型Hap3、Hap5 和Hap11 為6 個群體共享，其中Hap11 和Hap5 為優勢單倍型，分別占個體總數的30.23%和13.95%。單倍型Hap1、Hap15 和Hap18 為4 個群體共享，單倍型Hap9 為3 個群體共享，單倍型Hap4、Hap10、Hap13、Hap14、Hap17 和Hap28 為2 個群體共享，其余都為單個群體所特有單倍型。厚殼貽貝4 個地理群體的遺傳學參數見表1，單倍型多樣性指數為0.853(ZS)～0.912(XM)，群體總體的單倍型多樣性指數為0.876；核苷酸多樣性指數為0.005 55 (QD)～0.007 36(ZS)，群體總體的核苷酸多樣性指數為0.006 24，遺傳多樣性處于較高水平。

2.2 群體遺傳結構研究

分子方差分析(表4)結果顯示，100.15%的變異都來自于群體內部。群體間的遺傳分化系數FST值在在-0.021 79(QD-PT)至0.076 3(PT-XM)之間，15 個FST值中由9 個均為負值，其余的除(PT-XM)外，也都小于0.05，這表明各個群體之間幾乎沒有發生遺傳分化，存在高度的遺傳同質性。基因流范圍在3.026 54～32.429 74 之間，說明各群體之間基因交流頻繁(表5)。中性檢驗結果顯示，Tajima’s D 值以及Fu’s Fs 值的P 值均不顯著，表明厚殼貽貝未偏離中性選擇，群體沒有經歷過群體擴張(表1)。

用MEGA5.0[13]構建6 個群體單倍型系統發育樹如圖2，從圖中看出35 個單倍型樣本聚類為兩支，6 個群體的單倍型在兩支均有出現，并未發現存在群體分化的差異現象。

圖2 自檢舉值為1 000 次的單倍型鄰近系統發育樹(phylogenetic trees)Fig.2 The NJ tree of each haplotypes based on Nei's standard genetic distance with 1 000 bootstraps

表2 所有樣本的單倍型數目以及每個單倍型的變異位點Tab.2 The details of haplotypes,including the numbers of haplotypes and mutation sites

表3 厚殼貽貝群體的單倍型數量及登錄號Tab.3 Haplotype and accession numbers of M.coruscus populations

表4 基于線粒體DNA D-Loop 區域的厚殼貽貝樣品之間的成對FST 值與Nm 值Tab.4 Pairwise FST and Nm values among samples of M.coruscus using mtDNA D-Loop region

表5 基于線粒體DNA D-Loop 區域的厚殼貽貝樣品之間的AMOVA 分析Tab.5 AMOVA among samples of M.coruscus based on mtDNA D-Loop region

構建單倍型網絡圖如圖3，結果顯示單倍型網絡圖Hap3 和Hap5 是最主要的單倍型，單倍型聚類并未完全展示地域性特色，各地理群體的單倍型具有聚類現象，顯示出較近的親緣關系，結果與單倍型系統發育樹（圖2）情況相符。

圖3 6 個地區樣本的線粒體DNA D-Loop 區單倍型進化網絡圖Fig.3 The haplotypes network of six populations of M.coruscus

3 討論

遺傳多樣性參數是衡量群體遺傳多樣性程度的重要指標之一[17]。本研究中6 個厚殼貽貝群體的遺傳多樣性均表現出高的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性的特點，顯示出了較高水平的遺傳多樣性。這與前人利用線粒體COI[18]、COIII[19]及16sRNA[20]研究我國東南沿海厚殼貽貝遺傳多樣性的結果一致。厚殼貽貝體外受精、大規模的繁殖能力以及廣泛的幼蟲傳播方式可能是導致厚殼貽貝資源擁有高遺傳多樣性的原因。

我國沿海厚殼貽貝整體遺傳結構呈現單一薄弱的情況，6 個群體間的遺傳分化程度不明顯，各樣本的遺傳沒有發現明顯的遺傳分化現象，結果與單倍型網絡圖的結果相吻合，從AMOVA 中可以發現，大部分遺傳變異來自于樣本內部，樣本間的變異程度極小，這也是導致樣本，不具有明顯遺傳分化現象的因素之一。單倍型構建的進化樹雖然聚類為2 個主要分支，但分支內各單倍型不具有地理分布相吻合的特點，呈現混雜，分支呈現嵌套模式，說明單倍型的遺傳歧化不明顯。

一般而言，海洋生物與陸生生物相比，其種群遺傳結構和遺傳分化相對匱乏，這種匱乏緣于海洋環境缺乏像陸地環境一樣阻止生物擴散和交流的有效屏障[21]。大多數海洋雙殼類都擁有一段或長或短的浮游期，在此期間浮游幼蟲可以被動地隨著海洋潮流進行有效擴散傳播[22-24]。浮游期過后，這些貝類大都營固著生活(如貽貝、牡蠣等)或進行小范圍活動(如蚶、蟶、蛤等灘涂性貝類)。因此，海洋雙殼類的遺傳結構主要形成于其浮游期。一般而言，擁有較長浮游期的物種能夠在海洋潮流的推動下漂移較遠的距離，更易產生遺傳交流，造成單一的遺傳結構[25]。我國沿海厚殼貽貝整體遺傳結構呈現單一薄弱的情況，7 個群體間的遺傳分化程度不明顯，各樣本的遺傳沒有發現明顯的遺傳分化現象，結果與單倍型網絡圖的結果相吻合，從AMOVA 中可以發現，大部分遺傳變異來自于樣本內部，樣本間的變異程度極小，這也是導致樣本，不具有明顯遺傳分化現象的因素之一。單倍型構建的進化樹雖然聚類為兩個主要分支，但分支內各單倍型不具有地理分布相吻合的特點，呈現混雜，分支呈現嵌套模式，說明單倍型的遺傳歧化不明顯。這可能是由于厚殼貽貝與大多數的海洋雙殼動物一樣，在其生命發育周期中會有以浮游方式生存的幼蟲階段，大約需要約35 d[3]，在較長的浮游期內，幼體可以跟隨洋流漂浮到遠離其出生地的環境，甚至是其他群體的棲息地，這也就增加不同地區群體間的基因交流，降低不同群體之間的遺傳差異，縮小了遺傳分化的現象。

除此之外，我國沿海洋流構成十分復雜，除了數條沿岸流外，還有對本地區有重要影響的長江沖淡水、黑潮的支流、黃海的中央冷水團、東海的局部渦流等[26]，東海海區歷來是我國厚殼貽貝的主要產區，自然種質資源豐富，在每年冬季的繁殖季節會有大量幼蟲被散播在海區中；而冬季海區沿岸流主要沿北向南流動，黑潮及其支流暖流在外圍由南向北隔離了邊緣海與大洋間的交流，冬季同樣是我國沿岸江河的枯水期，從河口流入邊緣海的沖淡水大幅減少，這也進一步減弱對沿岸流的影響，而各海區內存在的渦流也促進了海區內環流的循環[27]。作為一種經濟海洋養殖貝類，厚殼貽貝的養殖市場廣闊，在人工育苗技術相對成熟的情況下，養殖從業者一般會從主產區中購買苗種后，運輸到養殖地進行養殖，而目前主要養殖方式是在自然海區利用附著基進行附苗養殖，開放的養殖方式會導致在繁殖季節，大量養殖樣本的幼蟲會被散播在海區內，與自然樣本的幼蟲混合后隨洋流傳播[28]。養殖樣本親本本身也是來自于單一的自然樣本，而大量的養殖樣本幼蟲的混入會導致遺傳多樣性的降低和樣本間遺傳結構的減弱，而目前育苗技術相對原始，選苗資源單一，也導致了養殖樣本近親交配情況凸顯。在養殖業缺乏對自然群體保護的管理下，大量養殖樣本的幼蟲勢必會沖淡自然樣本的遺傳多樣性，進而對自然樣本的遺傳結構產生沖擊。

4 小結

厚殼貽貝的群體遺傳學研究是更深入了解和揭示其自然環境下遺傳現狀，是識別厚殼貽貝遺傳管理單元合理利用其資源的必要途徑。本研究采用線粒體DNA D-Loop 區序列對采自我國沿海的7 個厚殼貽貝群體進行遺傳多樣性和遺傳結構分析，結果顯示出較高的遺傳多樣性水平和單一薄弱的遺傳結構。通過本研究的相關的實驗和分析，已經積累了相當的厚殼貽貝遺傳數據。而通過這些厚殼貽貝遺傳數據的分析，可以為我們在某些研究方面提供一些見解，比如遺傳管理單元的識別，種質資源的有效利用，也有助于我們理解在同一地區下，具有相似浮游幼蟲期的海洋貝類的遺傳結構。