LncRNA GAS5通過miR-21/ADAMTS-1途徑抑制大鼠肺纖維化

劉理靜,錢 紅,王 樂,胡 柯, 賀兼斌, 田玉梅

(1. 湖南醫藥學院護理學院，湖南 懷化 418000；2. 長沙民政職業技術學院醫學院，湖南 長沙 410004；3. 湖南醫藥學院醫學院，4. 湖南醫藥學院侗醫藥研究湖南省重點實驗室，5. 懷化市第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科，湖南 懷化 418000)

肺纖維化是一種難治性、致死性疾病，以Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ，Col Ⅰ)和Ⅲ型膠原(collagen type Ⅲ，Col Ⅲ)等細胞外基質成分在肺間質過度蓄積為特征[1-2]，因此，積極尋找調控Col Ⅰ、Col Ⅲ合成與分解代謝平衡的機制對于肺纖維化的防治具有重要價值。Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-1(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif，ADAMTS-1)是降解Col Ⅰ和Col Ⅲ最重要的酶，有較強的抗肺纖維化作用[3-4]。本課題組前期研究表明，miR-21通過靶向沉默ADAMTS-1，促進肺成纖維細胞Col Ⅰ和Col Ⅲ合成，從而加重大鼠肺纖維化病變[4-5]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一類非編碼 RNA分子，長度超過200 個核苷酸，不具有蛋白編碼功能。近年研究發現，lncRNAs能夠作為競爭性內源 RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)吸附miRNAs，上調miRNAs的靶基因表達，發揮生物學功能[6-7]。生長阻滯特異性轉錄本5(growth arrest-specific transcript 5，GAS5)是一種全長為630個核苷酸的lncRNA，與肝、腎纖維化相關[8-9]，但在肺纖維化中的作用有待闡明。我們前期通過生物信息學分析發現，GAS5與ADAMTS-1分享一個相同的miR-21 結合位點，表明3種RNA之間可能存在ceRNA調控模式。為此，本研究通過建立SD大鼠肺纖維化模型，探討GAS5對肺纖維化的影響及miR-21/ADAMTS-1途徑在其中的作用，旨在為這種難治性疾病的防治提供新靶點和理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人胚胎腎細胞(HEK)293T細胞株購于中國科學院上海細胞庫；美國Gibco公司提供胎牛血清(10099141)和DMEM高糖培養基(11965084)；pGL3載體(E1751)、脂質體3000轉染試劑(lipofectamineTM3000，L3000015)分別購自美國Promega公司、Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)為上海碧云天生物技術有限公司產品；雄性3-4月齡無特定病原體級健康SD大鼠30只，體質量(220.0±7.2)g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011；博萊霉素A5(批號：180901)購自天津太河制藥有限公司；GAS5過表達慢病毒載體(LV-GAS5)購于上海閃晶分子生物科技有限公司；廣州銳博公司提供miR-21激動劑(agomir)、miR-21 模擬物(mimic)及模擬物陰性對照物(Mimic-NC)；Ⅰ型前膠原羧基端前肽(procollagen type I carboxyterminal propeptide，PICP，ER0322)和Ⅲ 型前膠原氨基端前肽(procollagen type Ⅲ aminoterminal propeptide，PⅢNP，ER1221)的酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒為武漢菲恩生物科技有限公司產品；逆轉錄試劑盒(A5001)、SYBR? Green Real Time PCR Master Mix(QPK-201)、RIPA 裂解液(R0010)分別由美國Promega公司、日本 Toyobo公司、北京索萊寶科技有限公司提供；PVDF膜(T2234)和TRIzol試劑(15596026)為美國Invitrogen公司產品；兔抗大鼠ADAMTS-1(ab39194)、Col Ⅰ(ab34710)、Col Ⅲ(ab7778)、β-actin(ab8227)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(ab205718)購于英國Abcam公司。

1.2 儀器細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；輪轉式石蠟切片機(德國徠卡公司)；680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)；LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(美國Roche公司)；電泳儀和轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；化學發光凝膠成像分析儀(美國UVP公司)。

1.3 生物信息學預測利用Targetscan(http://www.targetscan. org/)、lnCeDB(http://gyanxet-beta.com/ lncedb/)、 PicTar(http://www.pictar.org/)等在線軟件預測GAS5、miR-21、ADAMTS-1 3′-非翻譯區(3′-untranslated region, 3′-UTR)之間的靶向結合情況。

1.4 熒光素酶活性檢測HEK293T細胞用含100 g·L-1胎牛血清的DMEM高糖培養液，于37 ℃，50 g·L-1CO2、飽和濕度條件下培養、傳代，實驗用對數生長期細胞。查找GAS5基因序列并通過PCR進行擴增，將擴增產物插入熒光素酶報告載體pGL3，構建野生型GAS5載體(GAS5-WT)，同時對GAS5序列中與miR-21結合的位點進行CTGGA到CCTTA的點突變，構建突變載體(GAS5-Mut)，按照操作說明使用lipofectamineTM3000，將以上質粒與miR-21 mimic或Mimic-NC共轉染HEK293T細胞48 h，利用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.5 大鼠肺纖維化模型的制備與處理♂健康SD大鼠30只，于無特定病原體環境中適應性飼養1周后，按隨機數字表法將其分為3組：對照組、LV-GAS5組和LV-GAS5+miR-21 agomir組，每組包含10只動物。然后按照課題組前期報道的方法建模[5]，即利用3 mL·kg-1的100 g·L-1水合氯醛向大鼠腹腔內注射，充分麻醉大鼠后切開頸正中位置，使氣管暴露，再將溶解了博萊霉素A5(5 mg·kg-1)的生理鹽水0.2 mL一次性向氣管內注入，然后迅速直立并旋轉大鼠，以使藥液均勻地分布于肺內，構建大鼠肺纖維化模型。給藥后次日(d 1)，LV-GAS5組大鼠尾靜脈注射0.2 mL含有1×1014TU·L-1的GAS5過表達慢病毒載體，LV-GAS5+miR-21 agomir組大鼠予相同體積的GAS5過表達慢病毒載體(1×1014TU·L-1)和miR-21 agomir(10 mg·kg-1)，而對照組大鼠尾靜脈注射0.2 mL的PBS，每2周注射1次，共2次。 d 28，麻醉大鼠后開胸，采集3 mL血液，以3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑15 cm)，提取上層血清，置入-20 ℃冰箱保存，用于檢測PICP和PⅢNP濃度。然后，處死大鼠，截取右肺組織，-70 ℃凍存，以備熒光實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和Western blot檢測；再用0.1 mol·L-1中性緩和福爾馬林經主支氣管注入左肺內，充分展開胸膜后，投入0.1 mol·L-1中性福爾馬林中固定1 d以上，再石蠟包埋后，5 μm厚度切片，病理組織學檢查。

1.6 肺組織病理學檢查將左肺石蠟切片行HE染色和Masson 染色，在光鏡下利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件觀察肺組織病理學改變。評定方法參照文獻[3,10]，肺組織肺泡炎癥程度評定使用HE染色：無肺組織炎，評為0分；肺組織炎的面積<20%，評為1分；肺組織炎的面積20%-50%，評為2分；肺組織炎的面積>50%，評為3分。肺組織纖維化程度評定使用Masson染色：無肺纖維化，評為0分；肺纖維化面積<20%，評為1分；肺纖維化面積在20%-50%，評為2分；肺纖維化面積>50%，評為3分。

1.7 酶聯免疫吸附法檢測血清PICP和PⅢNP濃度使用雙抗體夾心ELISA對各組大鼠血清PICP和PⅢNP濃度進行檢測，由專人嚴格按試劑盒提供的操作步驟進行。

1.8 qRT-PCR檢測GAS5、miR-21、ADAMTS-1表達收集各組大鼠右肺組織樣本，利用TRIzol試劑提取樣本中總RNA，再將提取的RNA通過逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。然后行PCR擴增，所用引物由上海生工生物工程公司按照Tab 1所示序列合成。利用SYBR? Green Real Time PCR Master Mix，在Roche 480實時熒光定量PCR儀上進行PCR反應，反應條件： 95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 sec，62 ℃退火20 sec，72 ℃延伸15 sec，總共40個循環。用ΔΔCt值法，以U6、GAPDH為內參照分別定量miR-21、GAS5和ADAMTS-1表達。

Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.9 Western blot檢測ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ表達利用RIPA蛋白裂解液從各組大鼠右肺組織樣本中提取蛋白質，BCA法對蛋白樣品濃度進行測定。然后上樣、電泳并轉PVDF膜，予50 g·L-1脫脂牛奶室溫下封閉4 h，再分別滴加兔抗大鼠ADAMTS-1(1 ∶1 000)、Col Ⅰ(1 ∶1 000)、Col Ⅲ(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶3 000)二抗，在37 ℃條件下孵育60 min，然后行ECL顯色，并于暗室內曝光。通過凝膠圖像分析系統(Labwork軟件)掃描所得膠片，用β-actin為內參照對ADAMTS-1、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白表達進行定量。

2 結果

2.1 鑒定GAS5、miR-21、ADAMTS-1間的ceRNA調控模式生物信息學預測發現(Fig 1)，GAS5與ADAMTS-1具有一個相同的miR-21 結合位點(GACC，即紅色框與藍色框重疊的部分)。而且，熒光素酶報告基因顯示(Fig 2)，miR-21 mimic不影響突變型GAS5熒光素酶活性(P>0.05)，但明顯減少野生型GAS5熒光素酶活性(P<0.01)，進一步表明GAS5能夠靶向結合miR-21。結合課題組前期研究已經鑒定ADAMTS-1為miR-21的靶基因，可確定GAS5、miR-21、ADAMTS-1之間存在ceRNA調控模式。

Fig 1 Binding sites among GAS5, ADAMTS-1 and miR-21 predicted by bioinformatics

Fig 2 Comparison of luciferase activity among groups n=3)

2.2 各組大鼠肺組織GAS5表達實驗過程中，各組大鼠均未出現死亡。實驗結束后，處死大鼠，提取右肺組織，利用qRT-PCR檢測GAS5表達水平，結果顯示(Fig 3)，相對于對照組，LV-GAS5組和LV-GAS5+miR-21 agomir組GAS5表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，提示構建的GAS5過表達慢病毒載體具有較高的感染效率。

Fig 3 Comparison of GAS5 expression in pulmonary tissues among groups n=10)

2.3 GAS5減輕肺纖維化大鼠肺組織病理改變采用HE染色(Fig 4)和Masson染色(Fig 5)觀察各組大鼠肺組織病理改變，發現對照組大鼠肺組織中有大量的炎性細胞浸潤及成纖維細胞增生，肺泡間隔顯著增厚，部分肺泡腔被纖維組織占據，肺泡壁被破壞，大量藍色膠原沉積于肺間質內，纖維化明顯；LV-GAS5組上述病理改變明顯減輕，而LV-GAS5+miR-21 agomir組病理改變較LV-GAS5組加重。定量分析顯示(Tab 2)，LV-GAS5組肺泡炎與肺纖維化程度評分相比于對照組均降低(P<0.01)，然而，與LV-GAS5組比較，LV-GAS5+miR-21 agomir組上述評分明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 The morphological changes of pulmonary tissues among groups (HE×200, scale bar = 100 μm)

Fig 5 The collagen deposition of pulmonary tissues among groups (Masson×200, scale bar=100 μm)

Tab 2 Effect of GAS5 on pathological changes of pulmonary tissues from pulmonary fibrosis rats n=10)

2.4 GAS5降低肺纖維化大鼠血清PICP和PⅢNP水平利用ELISA檢測各組大鼠血清PICP、PⅢNP水平，結果顯示(Tab 3)，LV-GAS5組血清PICP、PⅢNP水平較對照組降低(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組血清PICP、PⅢNP水平高于LV-GAS5組(P<0.01)。

Tab 3 Comparison of serum PICP and PⅢNP levels among groups n=10)

2.5 GAS5下調肺纖維化大鼠肺組織Col Ⅰ、Col Ⅲ表達Col Ⅰ、Col Ⅲ分別為PICP、PⅢNP的成熟體，為了進一步闡明GAS5 對肺纖維化大鼠肺組織中膠原蓄積的影響，采用Western blot檢測各組大鼠肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ表達。如Fig 6所示，LV-GAS5組Col Ⅰ和Col Ⅲ表達較對照組下調(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組Col Ⅰ和Col Ⅲ表達則明顯高于LV-GAS5組(P<0.01)，與血清PICP、PⅢNP水平變化一致。

Fig 6 Comparison of Col Ⅰ and Col Ⅲ expression in pulmonary tissues among groups n=10)

2.6 GAS5增加肺纖維化大鼠肺組織ADAMTS-1表達ADAMTS-1是降解Col Ⅰ、Col Ⅲ最重要的酶，且已經被鑒定為miR-21的靶基因，為了揭示GAS5抑制Col Ⅰ、Col Ⅲ表達的機制，通過qRT-PCR、Western blot分別檢測各組大鼠肺組織ADAMTS-1 mRNA與蛋白表達(Fig 7)，發現LV-GAS5組ADAMTS-1 mRNA與蛋白水平較對照組明顯升高(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組ADAMTS-1 mRNA與蛋白水平較LV-GAS5組降低(P<0.01)，提示ADAMTS-1介導GAS5對Col Ⅰ、Col Ⅲ表達的抑制作用。

2.7 GAS5降低肺纖維化大鼠肺組織miR-21表達通過qRT-PCR檢測各組大鼠肺組織miR-21表達(Fig 8)，發現LV-GAS5組miR-21水平明顯低于對照組(P<0.01)，而LV-GAS5+miR-21 agomir組miR-21水平較LV-GAS5組顯著增加(P<0.01)。

3 討論

肺纖維化為一種死亡率極高的呼吸系統疾病，是各種不同病因所致的肺間質疾病的共同結局，以肺泡間質炎性細胞浸潤、纖維母細胞增生和大量膠原沉積為特征，目前尚無有效的治療方法，嚴重危害人類健康。因此，以肺纖維化發病機理中的關鍵環節為突破口，開發靶向治療新藥對于改善患者預后具有十分重要的意義。GAS5是一種全長為630個核苷酸的lncRNA，定位于人1q25.1的小開放閱讀框。以往的研究多關注GAS5在腫瘤增殖、侵襲和轉移等方面的作用[11-12]，新近研究表明，GAS5也與纖維化疾病相關[8-9]，但在肺纖維化中的作用尚不清楚。本研究發現，GAS5過表達減輕大鼠肺纖維化病變，并降低血清PICP、PⅢNP水平，下調肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ表達，提示GAS5能夠促進Col Ⅰ和Col Ⅲ降解，發揮抗肺纖維化作用。

Fig 7 Comparison of ADAMTS-1 mRNA (A) and protein (B) expression in pulmonary tissues

Fig 8 Comparison of miR-21 expression in pulmonary tissues

LncRNA可作ceRNA 通過miRNA 應答元件與靶mRNA競爭性結合同種 miRNA分子，使miRNA 的水平下降，抑制 miRNA 對靶 mRNA 的沉默效應，進而上調靶基因的表達[6-7]。ceRNA是廣泛存在于動物體內的一種全新的基因表達調控模式，ceRNA調控網絡失調與肺纖維化的發生發展關系密切[13-14]。本研究中，GAS5與ADAMTS-1 3′-UTR分享一個共同的miR-21結合位點，而且miR-21模擬物明顯減少野生型GAS5熒光素酶活性，但對突變型GAS5熒光素酶活性無明顯影響，從而證實GAS5為miR-21的靶基因。同時，課題組前期研究已經鑒定ADAMTS-1為miR-21的靶基因[4-5]。因此，GAS5、miR-21、ADAMTS-1間存在ceRNA調控模式，這為探討GAS5促進Col Ⅰ和Col Ⅲ分解機制提供了新的方向。

miRNAs是一類在人體廣泛分布的內源性非編碼RNA，長度為19-25個核苷酸，在轉錄后水平抑制靶基因表達。miR-21定位于人17q23.2的脆性區域上，有促纖維化作用[15-16]。ADAMTS-1屬于一種Zn2+依賴的分泌型蛋白，是ADAMTS家族中第一個被發現的成員，分泌后經含 TSP-1 的血小板反應素同源域錨定于細胞外基質，通過金屬蛋白酶結構域分解Col Ⅰ和Col Ⅲ 等細胞外基質成分[17]。研究發現，miR-21過表達能明顯下調ADAMTS-1水平，進而增加肺組織Col Ⅰ和Col Ⅲ含量，從而加重博萊霉素所致的小鼠肺纖維化[18]。本研究發現，GAS5過表達降低miR-21水平，上調ADAMTS-1表達，而且miR-21 agomir處理可逆轉GAS5過表達對ADAMTS-1、Col Ⅰ、Col Ⅲ表達及肺纖維化病變的影響。因此，miR-21/ADAMTS-1途徑在GAS5抑制大鼠肺纖維化過程中發揮關鍵作用。

綜上所述，本研究結果表明，GAS5作為ceRNA吸附miR-21，上調ADAMTS-1表達，促進Col Ⅰ、Col Ⅲ降解，從而抑制博萊霉素所致的大鼠肺纖維化。隨著研究的深入，促進內源性GAS5表達可能是防治肺纖維化的新策略。

(致謝：本實驗在侗醫藥研究湖南省重點實驗室和懷化市第一人民醫院醫學中心實驗室完成，感謝各位同事和老師的幫助及指導。)