基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在腫瘤診斷及微生物鑒定中的應用

管明秀，張文成，王寶占，崔 喆，陳寶穎，張 霞

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是目前臨床診斷中一項創(chuàng)新技術(shù)，因其具有操作簡單、快速、高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，越來越多地被臨床實驗室認可， 已成為精準醫(yī)學不可缺少的分子診斷技術(shù)。血清腫瘤標志物可早期篩查無癥狀癌癥患者，已經(jīng)成為近年來蛋白質(zhì)組學關(guān)注的熱點之一，對于癌癥患者的早期篩查、早期診斷、早期治療，以及預測癌癥患者的預后具有不可估量的重要價值。

1 MALDI-TOF MS 在癌癥診斷中的應用

傳統(tǒng)的2D 凝膠電泳技術(shù)操作復雜，耗時費力，重復性差，對于小分子的低豐度蛋白的分離效果不好［1］，不適用于臨床診斷。 MALDI-TOF MS 與磁珠技術(shù)聯(lián)合可以篩選出血清低分子量蛋白/多肽，建立癌癥蛋白標志物的指紋圖譜診斷預測模型［2，3］。

1.1 MALDI-TOF MS 在食管癌診斷中的應用食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，是臨床上比較常見的消化道腫瘤。 全世界每年大約有30多萬人死于食管癌［4］。我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，病死率僅次于胃癌。 罹患食管癌的患者中，大約有80%是食管鱗狀細胞癌 （esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。 食管癌早期癥狀不明顯，70%的患者發(fā)現(xiàn)時，已經(jīng)處于晚期［5］。

張婷等［6］研究發(fā)現(xiàn)，利用弱陽離子交換磁珠（WCX-MB）提取血清蛋白/多肽后，經(jīng)MALDI-TOF MS 檢測59 例食管鱗癌患者及57 例健康體檢者血清，可以篩選出差異表達蛋白/肽，從而構(gòu)建了食管癌診斷預測模型。 該研究通過磁珠聯(lián)合MALDITOF MS 技術(shù)，運用遺傳算法（GA），監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡算法（SNN）以及快速分類算法（QC）建立了三種食管癌診斷預測模型，準確性分別為93.1%、89.7%和89.7%。 其中運用GA 建立的模型診斷效能最佳，特異性和敏感性分別為93.3%和92.9%。 該研究對食管癌診斷的敏感性遠高于Nakamura 等［7］研究證明食管癌的血清腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）的診斷敏感性為12.5%；細胞角蛋白19 片段（CYFRA21-1）的診斷敏感性 33.9%。 張等［6］研究還發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組多肽峰m/z 2660.84 和m/z 5336.49 表達上調(diào)，兩個峰的AUCROC 值分別為0.95 和0.91， 較比健康對照組具有顯著性差異。

通過MALDI-TOF MS 建立的食管癌診斷預測模型，具有較高的敏感性和特異度，適用于食管鱗癌高危人群的篩查和輔助診斷。 多肽峰m/z 2660.84 和m/z 5336.49 有望成為新食管鱗癌診斷標志物。

1.2 MALDI-TOF MS 在胃癌診斷中的應用 胃癌是來自胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤。 全球每年胃癌的發(fā)病率約100 萬［8］，我國的胃癌發(fā)病率占全球的50%以上［9］。在我國的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，胃癌的發(fā)病率位列第 2，病死率位居第 3 位［10］。目前胃癌的早期診斷存在很大的局限性［11］，糖類抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、CEA 等血清腫瘤標志物診斷胃癌的敏感性和特異性比較低［12］。目前MALDI-TOF MS聯(lián)合磁珠技術(shù)進行低豐度蛋白/肽檢測的蛋白質(zhì)組學研究成為關(guān)注的熱點［13］。

王娜娜等［14］利用 WCX-MB 聯(lián)合 MALDI-TOF MS 檢測60 例胃癌患者和60 例健康體檢者的血清，建立了相應蛋白表達指紋圖譜，篩選出差異表達蛋白/肽峰m/z 2952.57 和m/z 5904.36，兩個峰的AUCROC值分別為0.93 和0.81。運用GA 建立了胃癌診斷預測模型，該模型診斷靈敏度為93.3%，特異性為 90.0%。 YANG 等［15］利用 MALDI-TOF MS 檢測70 例胃癌患者和健康體檢者的血清，篩選出差異表達蛋白/肽峰m/z 5335.08 和m/z 1546.02，這與王娜娜等［14］篩選出的多肽峰具有相似性。 LIU 等［16］對 28例胃癌患者和16 例健康體檢者進行血清檢測，篩選出差異表達蛋白/肽峰m/z 5904.83。 以上進一步說明MALDI-TOF MS 檢測的可靠性。 WCX-MB 聯(lián)合MALDI-TOF MS 技術(shù)具有操作簡單、靈敏度高、快速等優(yōu)點， 適用于臨床診斷。 m/z 5904.36，m/z 5335.08 和m/z 5904.83 有望成為診斷胃癌的血清標志物。

1.3 MALDI-TOF MS 在甲狀腺微小結(jié)節(jié)良惡性診斷中的應用 中國抗癌協(xié)會于2016年發(fā)布了首個《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療專家共識》，認為甲狀腺微小乳頭狀癌經(jīng)手術(shù)治療可根除，5年生存率能夠達到98.5%［17］，部分患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤復發(fā)［18］，因此，對于甲狀腺微小結(jié)節(jié)的早期良惡性鑒別、合理規(guī)范治療，以及后期隨訪都有著重大的意義。 因甲狀腺微小結(jié)節(jié)體積小，超聲檢查誤診率高，診斷符合率僅為78.8%［19］，超聲引導下的細針穿刺雖然有比較高的敏感性和特異性， 但是也有因診斷可疑或取材不滿意而延誤診斷的情況發(fā)生［20］。 磁珠聯(lián)合 MALDI-TOF MS 能夠捕獲小分子蛋白/多肽，詹宇紅等［21］通過磁珠聯(lián)合MALDI-TOF MS 技術(shù)， 對65 例甲狀腺微小惡性結(jié)節(jié)和50 例微小良性結(jié)節(jié)進行血清檢測， 篩選出差異蛋白峰 m/z 3320.19、m/z 8127.39、m/z 4302.35，構(gòu)建了甲狀腺微小惡性結(jié)節(jié)診斷預測模型。 盲法監(jiān)測該診斷預測模型的敏感性為80%， 特異度為86.7%， 高于超聲檢查診斷［20］。 與盧秀波等［22］用MALDI-TOF MS 建立的甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的診斷模型的敏感度88.0%，特異度83.0%具有一致性。 m/z 3320.19、m/z 8127.39、m/z 4302.35 有望成為甲狀腺微小惡性結(jié)節(jié)的診斷血清標志物。

2 MALDI-TOF MS 在微生物鑒定中的應用

近年來MALDI-TOF MS 在微生物鑒定領(lǐng)域表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。 較比微生物鑒定傳統(tǒng)的檢測方法檢測周期長， 不能滿足臨床診療時效性的需要，尤其是針對菌血癥等重癥感染的患者，MALDI-TOF MS 可以直接使用臨床樣本， 或經(jīng)過分離培養(yǎng)出單菌落進行檢測，獲得蛋白質(zhì)譜圖，與微生物數(shù)據(jù)庫參考圖譜進行比對，進行菌屬、菌種的鑒定，縮短了鑒定時間［23，24］。 與傳統(tǒng)檢測微生物表型和生理生化反應的方法相比，MALDI-TOF MS 具有快速、準確、高通量和低成本的優(yōu)勢［25，26］。 現(xiàn)將 MALDI-TOF MS在微生物領(lǐng)域鑒定中的應用闡述如下。

2.1 細菌 最近研究證明，MALDI-TOF MS 在細菌鑒定方面具有顯著的優(yōu)勢，除了常見細菌［27，28］，還能 鑒定 出厭 氧菌［29］、分 枝桿 菌［30］等。 MALDI-TOF MS 對細菌進行鑒定的主要是依據(jù)對細菌生物標志物的分子量及分子結(jié)構(gòu)進行測定來完成。 細菌的生物標志物包括蛋白質(zhì)、核酸和脂類［31］。 由于細菌蛋白質(zhì)含量較高，具有高度保守性［32］，多樣性和豐富性，且易于提取和分離等特點，目前利用蛋白質(zhì)作為細菌鑒定的生物標志物得到廣泛應用。 Camara等［33］利用 MALDI-TOF MS 檢測大腸埃希菌的菌體蛋白，鑒定出了野生型大腸埃希菌和抗氨芐西林大腸埃希菌。

利用MALDI-TOF MS 對分枝桿菌進行鑒定時，需要通過特殊的蛋白提取步驟，萃取蛋白，進行分枝桿菌蛋白標志物數(shù)據(jù)庫的建立，通過比對結(jié)果達到對分枝桿菌鑒定的目的［34］。

Zarate［35］研究證實，用 MALDI-TOF MS 通過低分子量蛋白譜的建立，對厭氧菌的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)細菌鑒定技術(shù)的一致率達到95.3%。 MALDI-TOF MS 在提高厭氧菌導致的內(nèi)源性感染疾病的快速診斷率方面具有更高的價值。

2.2 真菌 MALDI-TOF MS 鑒定臨床常見真菌如酵母菌的準確性比較高［36］。 Becker 等［37］研究顯示MALDI-TOF MS 診斷絲狀真菌的準確率達到95.4%。 黃艷飛等［38］研究顯示使用“水平震蕩培養(yǎng)法”配合改良磁珠提取法提取蛋白，利用質(zhì)譜鑒定絲狀真菌鑒定到屬的準確率可以達到99%。 目前已經(jīng)建立了龐大的MALDI-TOF 絲狀真菌數(shù)據(jù)庫，這對于絲狀真菌鑒定具有可觀的臨床應用價值。

2.3 病毒 由于病毒具有細胞內(nèi)寄生的特點，所以分離培養(yǎng)很困難，而且耗時長。 MALDI-TOF MS 憑借快速、高通量的特點，在病毒鑒定方面具有明顯的優(yōu)勢。 萬敏等［39］研究顯示利用 MALDI-TOF MS 對人乳頭瘤病毒（HPV）進行分型診斷的敏感性88.2%，特異度88.9%；對高危型HPV 診斷的準確率達到了100%。 MALDI-TOF MS 對于病毒的診斷與傳統(tǒng)技術(shù)相比具有很高的一致性［40］，同時又具備高通量、快速等特點，對于未來廣泛應用于病毒檢測具有廣闊的前景。

2.4 放線菌 放線菌是一類具有絲狀分枝細胞的原核微生物。 它的細胞構(gòu)造、細胞壁的化學成分和對噬菌體的敏感性與細菌相同，但在菌絲形成以及外生孢子繁殖方面與絲狀真菌相似。 大多數(shù)放線菌是條件致病菌，可以導致放線菌病，造成皮膚軟組織、頭頸部、以及生殖器官膿腫［41］。 孫銘艷等［42］研究顯示來自患者膿腫皮膚的菌株，培養(yǎng)72 h 后，可見白色、細小、無溶血環(huán)的菌落，經(jīng)過革蘭氏染色涂片可以見到革蘭氏染色陽性桿菌， 但是未見明顯菌絲，VITEK2 Compact 鑒定結(jié)果為肺炎鏈球菌和雙歧桿菌屬， 與染色鏡檢結(jié)果不符。 使用MALDITOF MS 進行鑒定結(jié)果為歐洲放線菌。 該研究還對菌株 DNA 進行提取，選用 16S rRNA［43］基因測序進行鑒定，鑒定結(jié)果也為歐洲放線菌，與MALD-TOF MS 鑒定結(jié)果一致。 因MALDI-TOF MS 具有高通量、快速的診斷優(yōu)勢，所以其對放線菌病的及時診斷具有非常重要的意義。

3 MALDI-TOF MS 面臨的挑戰(zhàn)

MALDI-TOF MS 雖然具有快速、高通量、敏感、特異等優(yōu)點，但是在臨床應用過程中還存在很多挑戰(zhàn)，缺乏操作的規(guī)范標準化要求，例如質(zhì)量控制、樣品的前處理流程、鑒定流程、報告及審核流程、報告解釋、生物安全標準、儀器操作的標準化、數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量都會影響最終的鑒定結(jié)果。 目前大腸埃希菌和志賀菌運用MALDI-TOF MS 還不能嚴格區(qū)分，需要附加試驗才能加以鑒定［44］；對于變形桿菌的鑒定，MALDI-TOF MS 也只能鑒定到屬， 無法進行種的鑒定［45］。

MALDI-TOF MS 雖然存在一定的局限性，但通過規(guī)范標準化操作規(guī)程，完善建立的數(shù)據(jù)庫，該技術(shù)定能以高效、快速、廣泛的優(yōu)勢在腫瘤診斷領(lǐng)域和臨床微生物診斷領(lǐng)域中更好地服務于臨床，服務于患者。