基于表觀遺傳學(xué)探討針灸緩解內(nèi)臟高敏感的可能機制＊

郭 靜，裴麗霞，宋亞芳，孫建華

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南京 210029）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以腹痛及排便習(xí)慣改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的功能性腸病[1]。內(nèi)臟高敏感是IBS重要的發(fā)病機制，主要表現(xiàn)為內(nèi)臟痛覺過敏、感覺異常，在接受擴張刺激時，結(jié)直腸的容積和壓力閾值均明顯降低[2]。內(nèi)臟高敏感的機制尚不清楚，可能與結(jié)腸傷害性刺激輸入、腸道通透性增加、腸神經(jīng)內(nèi)分泌活動改變等有關(guān)[3,4]。近年來，日趨增多的證據(jù)表明，表觀遺傳修飾在慢性內(nèi)臟疼痛的致敏和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5,6]。臨床研究表明針灸治療IBS 安全有效[7]，動物實驗顯示針灸可以緩解IBS 內(nèi)臟高敏感[8,9]。針灸緩解內(nèi)臟高敏感的機制復(fù)雜，表觀遺傳修飾可能參與其中。

1 表觀遺傳學(xué)的定義與基本內(nèi)容

表觀遺傳學(xué)是指由發(fā)育或環(huán)境因素引起的，在沒有DNA 序列改變的情況下，基因功能發(fā)生穩(wěn)定的、可遺傳的改變。其基本內(nèi)容包括：DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控、染色質(zhì)重塑等[10-14]。DNA甲基化是指在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化作用下，將甲基基團與DNA 的CpG 二核苷酸的胞嘧啶核苷共價結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達[15]。組蛋白修飾包括甲基化、乙?；⒎核鼗⒘姿峄?、糖基化等，通過影響組蛋白與DNA 的親和性從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)[16]。組蛋白修飾不僅可以直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，還可以影響DNA的修復(fù)與復(fù)制、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期等[12]。非編碼RNA 包括長鏈非編碼RNA 和短鏈非編碼RNA，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控[17,18]。同時，非編碼RNA 能夠參與DNA 甲基化、組蛋白修飾等環(huán)節(jié)，引起基因的沉默或上調(diào)[13]。

2 表觀遺傳學(xué)與內(nèi)臟高敏感

2.1 DNA甲基化與內(nèi)臟高敏感

中樞致敏是IBS 患者內(nèi)臟高敏感重要原因之一，應(yīng)激引起的下丘腦- 垂體- 腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamic-pituitary adrenal，HPA）激活在其中扮演重要角色[5]。近年來一些研究顯示DNA甲基化參與調(diào)節(jié)應(yīng)激誘發(fā)的內(nèi)臟高敏感。反復(fù)避水應(yīng)激（water avoidance stress，WAS）可以引起嚙齒類動物內(nèi)臟疼痛，是常用的IBS 內(nèi)臟高敏感的模型[19,20]。一項研究結(jié)果表明，WAS 應(yīng)激大鼠表現(xiàn)出內(nèi)臟敏感性增加，杏仁核中糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）基因的甲基化增加而促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropin releasing factor，CRF）啟動子的甲基化減少，伴隨著GR mRNA 的表達減少而CRF mRNA 表達增加。而在腦室中注入組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑曲古抑菌素A 可顯著緩解WAS 引起的內(nèi)臟超敏反應(yīng)[21]。早期生活應(yīng)激的母嬰分離模型同樣可以使HPA 軸活化，CRF 的表達增加[5]。在另一項研究表明，母嬰分離引起的HPA 軸活化與CRF 啟動子低甲基化有關(guān)，并增強了成年后CRF 對應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[22]。針灸可以減少腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）患者及模型大鼠血清及下丘腦中CRF 的表達，減輕內(nèi)臟高敏感癥狀[23,24]。目前，針灸調(diào)控CRF 的上游機制尚未闡明，針灸是否可以通過降低CRF啟動子DNA甲基化水平，調(diào)節(jié)HPA 軸從而緩解內(nèi)臟高敏感有待進一步證明。

此外，表觀遺傳在應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)臟超敏反應(yīng)外周機制中同樣發(fā)揮作用。WAS 大鼠L6-S2 背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）中糖皮質(zhì)激素受體基因（nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1；NR3C1）啟動子的甲基化增加，下調(diào)了NR3C1 的轉(zhuǎn)錄和表達。DNMT1 相關(guān)的大麻素1 型受體基因（cannabinoid receptor 1 gene，CNR1）啟動子甲基化上調(diào)，同時由NR3C1 介導(dǎo)的CNR1 表達下調(diào)。敲低大鼠L6-S2 DRG 神經(jīng)元中的DNMT1 可以減少CNR1 啟動子甲基化，并降低慢性應(yīng)激引起的內(nèi)臟痛[25]。內(nèi)源性大麻素受體廣泛分布于痛覺的傳導(dǎo)通路中，同時參與了針刺誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用[26,27]。針刺發(fā)揮減輕內(nèi)臟高敏感是否通過調(diào)節(jié)CNR1 啟動子的甲基化水平有待考證。

針灸調(diào)控DNA 甲基化緩解IBS 內(nèi)臟高敏感尚處于空白階段，但我們可以從針灸在其他疾病關(guān)于DNA甲基化機制的探索中找尋依據(jù)。電針大腸俞募穴干預(yù)慢性傳輸型便秘大鼠后發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸組織中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）啟動子區(qū)的 CpG 水平增加，甲基化水平降低，影響了GDNF 的基因轉(zhuǎn)錄水平[28]。研究發(fā)現(xiàn)，IBS 結(jié)腸和脊髓組織中GDNF 高表達，艾灸可以降低GDNF 及 GDNF 家族受體α3 的表達[29]。艾灸是否通過調(diào)節(jié)GDNF 啟動子區(qū)的甲基化水平，影響GDNF 的表達，從而發(fā)揮對IBS 的治療效應(yīng)，還有待進一步探索。在一項電針干預(yù)多囊卵巢綜合征模型大鼠的研究中，電針降低了下丘腦中整體DNA 甲基化水平和DNMT3b 的表達。焦磷酸測序表明，電針干預(yù)后Camk2b 和 Ar 的 DNA 甲基化水平降低[30]。艾灸“足三里”穴位局部可以引起低甲基化改變，主要發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)[31]?！白闳铩笔侵委烮BS 內(nèi)臟高敏感常用選穴，我們猜測針灸可能是通過引起某些靶基因低甲基化改變從而緩解內(nèi)臟高敏感。

2.2 組蛋白修飾與內(nèi)臟高敏感

環(huán)境或慢性應(yīng)激對表觀基因組的重塑可能導(dǎo)致基因表達的長期變化?，F(xiàn)有研究表明，組蛋白去乙?；赡芗又貎?nèi)臟疼痛，而HDAC 抑制劑可以通過增加組蛋白乙酰化水平來減輕內(nèi)臟高敏感。中央杏仁核（central amygdala，CeA）中的表觀遺傳程序，特別是組蛋白修飾，在維持慢性焦慮和疼痛中非常重要。CeA長時間暴露于升高的皮質(zhì)類固醇（corticosteroids，CORT），通過激活GRs 和CRF 促進長期焦慮和內(nèi)臟疼痛[32]。一項研究利用染色質(zhì)免疫沉淀實驗證實CeA 中GR 表達的降低是由于GR 啟動子處組蛋白3 賴氨酸9乙酰化（histone 3 lysine 9 acetylation，H3K9Ac）的減少所導(dǎo)致的。此外，H3K9Ac 的減少可能是由于組蛋白去乙酰基酶Sirtuin-6的活性增加引起的。Sirtuin-6可以通過CORT 誘導(dǎo)的NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)募集到GR 啟動子區(qū)域。在CeA 內(nèi)注射HDAC 抑制劑可以通過恢復(fù)GR 啟動子上H3K9Ac 來防止GR 表達的下降，從而逆轉(zhuǎn)CORT誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感[33]。

組蛋白修飾在內(nèi)臟高敏感外周機制中作用的現(xiàn)有研究主要集中在組蛋白乙?；?去乙?；瘜ο嚓P(guān)受體的調(diào)節(jié)。瞬時受體電位辣椒素受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是 IBS 內(nèi)臟高敏感重要的外周機制之一。慢性應(yīng)激會增加L6-S2 DRG 神經(jīng)元中TRPV1 啟動子處的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶EP300 的表達，增加TRPV1 啟動子的組蛋白乙?；瑥亩鴮?dǎo)致TRPV1的表達的增加，形成內(nèi)臟高敏感。敲低大鼠DRG 神經(jīng)元中的EP300 減少了TRPV1 啟動子的組蛋白H3 乙酰化，并預(yù)防了應(yīng)激大鼠的內(nèi)臟痛覺過敏[25]。谷氨酸是迷走神經(jīng)回路中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor，mGluR）與內(nèi)臟高敏感密切相關(guān)[34]。在慢性應(yīng)激的大鼠模型中，HDAC 抑制劑可以增強脊髓中H3K9Ac、雌激素受體α與代謝型谷氨酸受體2 型基因（metabotropic glutamate receptor type 2 gene，GRM2）啟動子相同區(qū)域的結(jié)合，減輕雌激素引起的內(nèi)臟高敏感[35]。該團隊后來進一步研究顯示HDAC 抑制劑增加了脊髓中 H3K9Ac、H3K18Ac 與 GRM2、GRM3 啟動子上的幾個位點的結(jié)合，上調(diào)了mGluR2 和mGluR3 的表達，并減輕了應(yīng)激引起的內(nèi)臟超敏反應(yīng)[36]。

目前尚無針灸通過改變組蛋白修飾緩解內(nèi)臟高敏感的研究，但是朱冰梅老師團隊首次揭示的針刺保護缺血性心肌病的表觀遺傳調(diào)控機制為我們提供了很好的思路。研究表明針刺能明顯增加血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）啟動子上H3K9Ac，從而證實針刺可通過調(diào)控組蛋白H3K9Ac 水平，促進VEGF 轉(zhuǎn)錄表達，介導(dǎo)缺血心肌血管新生，實現(xiàn)心肌保護效應(yīng)[37]。新近研究顯示，針刺百會、印堂穴可以通過下調(diào)慢性應(yīng)激模型大鼠海馬HDAC2 蛋白表達，促進海馬組蛋白H3K3 乙?；黾幽X源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表達，緩解大鼠的抑郁樣行為[38]。BDNF同時又與IBS 內(nèi)臟高敏感相關(guān)，前期臨床研究顯示針刺可以降低IBS-D 患者血清BDNF 水平[39]，進一步可以探究針刺是否通過調(diào)控組蛋白修飾改變BDNF的表達，從而發(fā)揮緩解內(nèi)臟高敏感的效應(yīng)。

2.3 非編碼RNA與內(nèi)臟高敏感

2008 年 microRNA（miRNA）開始出現(xiàn)在 IBS 機制研究中。研究顯示miRNA-510 和血清素受體3E 基因共定位在IBS-D 患者的腸上皮細(xì)胞中，表明特有的miRNA 存在于 5-HT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的 IBS 患者中[40]。5-HT信號傳遞系統(tǒng)與腸道感覺密切相關(guān)，在IBS 發(fā)病中發(fā)揮重要作用。隨后多個研究報道了miRNA-24、miRNA-16、miRNA-103 和 miRNA-200a 對 5-HT 信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。IBS 患者和小鼠結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞中miRNA-24 表達增加。5-HT 轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）是miR-24 的潛在靶基因。miRNA-24抑制劑可以增加IBS小鼠近端結(jié)腸的疼痛閾值和傷害性閾值水平，降低過氧化物酶活性，并上調(diào)腸粘膜上皮細(xì)胞SERT 的mRNA 和蛋白表達水平[41]。另一項研究表明，IBS-D 患者空腸中miRNA-16 和miRNA-103 表達水平降低可能導(dǎo)致5-HT4 受體活性升高，進而引起腸道分泌和蠕動增加[42]。在IBS-D 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miRNA-200a 可以通過下調(diào)CNR1 和SERT加重IBS內(nèi)臟高敏感[43]。

據(jù)報道，IBS-D 患者血液微囊泡、小腸和結(jié)腸組織中均存在miRNA-29a 表達增加。miRNA-29a 的互補序列與谷氨酰胺合成酶（glutamate-ammonia ligase，GLUL）基因的 3'-UTR 結(jié)合，減少了 GLUL 的合成，從而增加腸道黏膜通透性[44]。該團隊進一步在IBS 患者和miRNA 基因敲除（Mir29-/-）小鼠模型中驗證miRNA-29 家族對腸道通透性的影響，研究表明miRNA-29a/b 可以通過降低閉合蛋白-1（claudin 1）和NF-κB 抑制因子的表達，增加腸道通透性[45]。在IBSD 大鼠模型中miRNA-29a 的作用機制也得到了證實，上調(diào)的miRNA-29a 可以降低水通道蛋白1（aquaporin 1，AQP1）、AQP3、AQP8 的表達，增加腸道通透性[46]。此外，一項新近研究進一步探索了miRNA-29a 介導(dǎo)5-HT 信號系統(tǒng)在內(nèi)臟高敏感的機制作用，5-HT7 受體是miRNA-29a的直接靶標(biāo)，miRNA-29a敲除可以導(dǎo)致5-HT7受體的過表達和內(nèi)臟痛覺過敏的減弱[47]。

IBS 患者血液中循環(huán)miRNA-150 和miRNA-342-3p表達水平升高。值得注意的是，miRNA-150與腸道炎癥及疼痛密切相關(guān)，而miRNA-342-3p 則可以通過電壓門控性L型鈣離子通道α1C蛋白來進行疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低結(jié)直腸痛閾，從而增加內(nèi)臟敏感性[48]。本團隊前期通過篩選IBS-D 患者與健康志愿者血清miRNA 差異表達譜系，發(fā)現(xiàn)IBS-D 患者血清中miRNA-1305、miRNA-575、miRNA-149-5p、miRNA-190a-5p、miRNA-135a-5p、miRNA-148a-3p 表 達 上調(diào)，miRNA-194-5p、miRNA-127-5p 表達下調(diào)。針刺可以下調(diào)IBS-D患者血清miRNA-148a-3p的表達。

IBS-D 患者結(jié)腸組織中miRNA-199 表達明顯下降。miRNA-199 的表達水平與VAS 評分及胃腸道癥狀呈負(fù)相關(guān)。通過熒光素酶報告檢測，從分子機制水平證實了miRNA-199 是TRPV1 關(guān)鍵的調(diào)控因子，miRNA-199 在細(xì)胞內(nèi)可以通過抑制TRPV1-mRNA 的轉(zhuǎn)錄的方式下調(diào)TRPV1 的表達。IBS-D 患者miRNA-199 缺乏直接造成TRPV1 表達增加，導(dǎo)致了IBS 患者的慢性內(nèi)臟疼痛[49]。本團隊尚未發(fā)表的研究結(jié)果表明，IBS-D 患者與健康志愿者相比結(jié)腸組織中miRNA-199 的表達下降，TRPV1 表達升高。經(jīng)過12周的針刺治療，患者腹痛等不適癥狀得到有效緩解。針刺可能是通過上調(diào)miR-199，減少TRPV1 的表達發(fā)揮效應(yīng)。

3 基于表觀遺傳學(xué)對內(nèi)臟高敏感的治療

表觀遺傳標(biāo)記由表觀遺傳修飾酶催化和維持，一般來說是可以長期持續(xù)的，但在某些條件下可以被修改甚至逆轉(zhuǎn)。表觀遺傳標(biāo)記的可逆性和表觀遺傳修飾酶的抑制劑為內(nèi)臟高敏感的表觀遺傳相關(guān)治療的發(fā)展提供了潛力。上文中提及的一些臨床前研究提示，HDAC 抑制劑可能是緩解IBS 相關(guān)的內(nèi)臟高敏感的潛在方法。HDAC 抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）可以逆轉(zhuǎn)早期應(yīng)激引起的內(nèi)臟高敏感反應(yīng)和結(jié)腸動力增加[50]。在中樞CeA 內(nèi)注射HDAC 抑制劑可以通過增加GR啟動子上H3K9Ac，恢復(fù)GR表達水平，從而逆轉(zhuǎn)CORT 誘導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感[33]。在脊髓水平，HDAC 抑 制 劑 增 加 了 脊 髓 中 H3K9Ac、H3K18Ac 與GRM2、GRM3 啟動子上的幾個位點的結(jié)合，上調(diào)了mGluR2 和mGluR3 的表達，從而減輕內(nèi)臟高敏感[36]。目前被批準(zhǔn)用于臨床的HDAC 抑制劑包括羅米地辛、伏立諾他、貝利司他、西達本胺，主要用于惡性腫瘤的治療，尚無用于緩解IBS 內(nèi)臟高敏感的HDAC 抑制劑藥物。DNA 甲基化、組蛋白乙酰化、miRNA 等過程參與IBS 內(nèi)臟高敏感形成。針灸可以緩解內(nèi)臟高敏感，盡管基于表觀遺傳學(xué)探討針灸相關(guān)機制的研究仍為空白，但是前輩們關(guān)于針刺調(diào)控表觀遺傳學(xué)的相關(guān)結(jié)論以及本團隊圍繞miRNA 展開的兩項探索性實驗，為未來該領(lǐng)域的研究提供了思路。

4 結(jié)語

綜上，表觀遺傳調(diào)控在IBS 內(nèi)臟高敏感的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。IBS 是一種環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的疾病，環(huán)境和應(yīng)激可以導(dǎo)致表觀遺傳標(biāo)記的持續(xù)性改變。在研究IBS內(nèi)臟高敏感機制時引入表觀遺傳調(diào)控，可以為我們提供更全面的視角。DNA 甲基化、組蛋白修飾、miRNA 調(diào)控可以導(dǎo)致離子通道或受體表達的長期變化，改變神經(jīng)元的興奮性，促進慢性內(nèi)臟疼痛的發(fā)生。表觀遺傳修飾在某種程度上是可逆的，DNMT 抑制劑、HDAC 抑制劑可以逆轉(zhuǎn)內(nèi)臟高敏感，目前這些藥物尚停留在臨床前實驗階段。針灸可以有效緩解IBS 內(nèi)臟高敏感，一些前期的探索性研究提示表觀遺傳調(diào)控機制可能參與其中。然而表觀遺傳調(diào)控機制在該領(lǐng)域的研究尚處于空白狀態(tài)，我們有理由相信表觀遺傳學(xué)可以為針灸治療IBS內(nèi)臟高敏感的機制探索提供較好的研究方向。