二代測序技術檢測呼吸道非典型病原體應用進展

何靜 黃丹輝 董航明 蔡紹曦

南方醫科大學南方醫院呼吸與危重癥醫學科，慢性氣道疾病研究室（廣州510515）

呼吸道感染是臨床常見疾病，也是主要致死性疾病，根據世界衛生組織（WHO）2018年發布的數據，2016年下呼吸道感染在全球造成300 萬人死亡［1］。呼吸道感染的致病原復雜，除常見的細菌外，還有病毒、真菌、支原體、衣原體和軍團菌等廣義上的非典型病原體［2］。傳統的非典型病原體檢測技術包括涂片鏡檢和培養，需要專業人員耗費長時間進行分離和鑒定，且非典型病原體的培養條件往往較苛刻，致檢出陽性率低。新興的免疫學檢測和核酸擴增技術包括PCR 和基因芯片檢測等步驟復雜、操作要求高，且需要對樣本中可能存在的病原體進行預判，無法準確檢出混合病原體及未知病原體，難以滿足臨床及科研需求［3］。

隨著分子生物學的發展，通量更高、敏感性更高、速度更快、成本更低的二代測序（next?genera?tion sequencing，NGS）技術已經廣泛應用在微生物組學的研究中，并逐漸與臨床病原學診斷相結合，為檢測呼吸道非典型病原體提供了新的思路?，F將目前關于NGS 技術與呼吸道非典型病原體檢測的相關研究進行綜述，并對NGS 的應用提出問題和展望。

1 NGS 技術簡介

NGS 工作流程主要包括DNA 樣本制備、文庫構建及驗證、大規?？寺U增和測序，使用了區別于Sanger 測序法的測序化學和單分子聚合酶鏈式反應，使同時處理數十億個高質量的堿基對成為可能。基于NGS 發展的感染性疾病病原體檢測技術主要包括宏基因組測序（metagenomics next?gen?eration sequencing，mNGS）、全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）以及擴增子測序（以16S rRNA和ITS測序為代表）。目前常見的NGS平臺主要有Roche 公司的454 技術、Illumina 公司的Solexa和Hiseq 技術、Helicos 公司的Heliscope 單分子測序儀和ABI 公司的Solid 技術，測序時間一般不超過48 h，最快可以在8 h 內實現從DNA 樣本建庫到數據分析獲取全過程，充分體現其快速、高通量的優點。

2 NGS 在感染性疾病中的應用及優勢

2014年WILSON 等［4］應用NGS 技術檢出兒童腦脊液樣本中的鉤端螺旋體，這是世界上第一例臨床應用NGS 技術診斷感染性疾病的報道，體現了NGS 技術在檢測非典型病原體等難分離、難培養致病原上的優勢。MIAO 等［5］報道了目前中國最大規模的關于mNGS 檢測感染性疾病病原體的回顧性分析研究，共納入511 例樣本，其中255 例下呼吸道感染，發現mNGS 的敏感度和特異度分別為50.7%和85.7%，顯著高于傳統培養手段，尤其在檢測結核桿菌、病毒、真菌和厭氧菌等病原體上。

《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南（2018 版）》［6］指出，NGS 等分子生物學技術可以提高病原檢測敏感度，縮短檢測時間，尤其對少見和罕見病原體的診斷有重要意義。綜上所述，基于NGS 的病原體檢測技術已經逐步在臨床診斷領域推廣并開始獲得認可，臨床工作者需要充分認識并選擇性地利用這項技術解決臨床問題。

3 NGS在呼吸道非典型病原體檢測中的應用

3.1 NGS 在診斷呼吸道非典型病原體感染中的應用病毒是呼吸道感染的常見病原體之一，具有種類多、變異快、難分離、培養條件復雜等特點，目前臨床上主要采用核酸檢測技術進行檢測。有研究表明，與基于PCR 的核酸檢測相比，NGS 對呼吸道病毒的檢出率更高，且能檢出被常規檢測手段遺漏的病毒［7］。YAN 等［8］報道了1 例經mNGS 診斷的罕見人類鼻病毒（HRV）B91 呼吸道感染，該病例中多重實時PCR 技術也曾檢出HRV，但未能進一步鑒定亞型，因此被誤認為是非致病病原體。上述報道說明PCR 方法對檢測罕見突變株有一定局限性，這與PCR 需要預先設計引物有關，而NGS可以直接對臨床樣本中的病原體進行鑒定，提高了對罕見呼吸道病毒感染的診斷能力。NGS 技術鑒定新型呼吸道病毒感染的優勢在2019年底中國武漢的新型冠狀病毒肺炎疫情中得到了充分體現，研究人員在五天內完成了新型冠狀病毒的全基因組鑒定和分析，而2013年基于實時PCR 技術進行的H7N9 流感病毒鑒定則耗時1月余［9］。綜上所述，實時PCR 技術檢測具有速度快、成本低和易獲取等優點，適合大規模人群篩查；而NGS 對呼吸道病毒的檢出率高，能進一步減少因實時PCR 檢測假陰性導致的漏診，且能彌補PCR 檢測診斷罕見或新型病毒感染上的不足。

隨著廣譜抗生素和免疫抑制類藥物使用增加，呼吸道真菌感染的發病率不斷增高，而涂片鏡檢、培養和抗原抗體檢測等常規檢測手段陽性率較低、難以區分菌種，容易造成漏診。XIAO 等［10］報道了首例經NGS 檢出的尖端賽多孢子菌肺炎，該病例中NGS 在28 h 內得到檢測結果，而傳統培養技術需要耗時數天。同時，尖端賽多孢子菌的鏡下群落形態與曲霉菌相似，容易造成混淆。因此，與傳統培養技術相比，NGS 可以更快速、準確地為呼吸道真菌感染提供病原學證據。LI 等［11］對20 例可疑感染的肺活檢組織進行研究發現，與組織病理學檢測相比，NGS 可以檢出更多根霉、毛霉等結合菌，這可能與NGS 樣本不需經過研磨加工有關，從而更真實地還原呼吸道真菌群落。

支原體和軍團菌的培養要求較一般細菌高，培養陽性率低，而衣原體甚至需要采用細胞培養技術，通常不通過培養進行臨床診斷。隨著分子病原診斷技術的發展，以PCR 為基礎的肺炎支原體、衣原體核酸擴增技術已被批準用于臨床，為早期、快速診斷提供依據［12］，體現了核酸檢測技術在臨床診斷中的重要價值。而NGS 尚未用于呼吸道支原體、衣原體感染的常規檢測，其相關報道和研究較少。

李學青等［13］收集34 例重癥肺炎患兒的肺泡灌洗液進行分析，其中20 例肺炎支原體感染的mNGS 結果與血清抗體檢測結果相符，肯定了NGS檢測肺炎支原體的能力。朱榕生［14］和邱崇榮［15］各報道了1 例經NGS 診斷的鸚鵡熱衣原體肺炎，彌補了傳統檢測手段在檢測少見病原體上的不足。NGS 理論上可以實現全面、無偏倚地檢測病原體，而PCR 技術也有其特異性高、省時等優點，因此現階段在結合患者臨床癥狀初步考慮呼吸道支原體或衣原體感染可能的情況下，仍推薦使用常規檢測方法，將NGS 作為補充手段。

目前尚無NGS 用于呼吸道嗜肺軍團菌臨床診斷的報道，HUANG 等［16］2019年報道了第一例mNGS 診斷的非嗜肺軍團菌關節感染，而傳統培養手段未檢出軍團菌感染，這一報道體現了NGS 在檢測軍團菌屬中有很大潛力。

此外，非典型病原體容易合并細菌感染，常規檢測手段難以鑒別，而NGS 可以在單個樣本中同時鑒定多個病原體，在鑒別混合感染和多重感染中發揮重要作用。LANGELIER 等［17］在免疫功能受損的呼吸道感染病人的肺泡灌洗液中檢測出HCOV 229E、HRV?A、HHV?6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及輸血傳播型病毒等多種病毒，還發現了罕見的輕型鏈球菌及丙酸棒桿菌，且病毒與細菌共存可明顯加重患者的臨床癥狀。王桂禎等［18］報道了1 例多重真菌與細菌混合呼吸道感染，傳統鏡檢和血清學檢查均為提示呼吸道真菌感染，痰培養示白念珠菌，但無法明確判斷病原菌，治療效果欠佳，NGS 技術成功檢出白念珠菌、曲霉菌、肺炎鏈球菌等多種病原體，為調整治療方案指明方向。這提示免疫功能受損或重癥呼吸道感染患者可能存在傳統檢測技術遺漏的多重病原體感染，在抗感染治療效果欠佳的情況下可進一步行NGS 檢測。另外，有研究者提出NGS 可用于快速鑒定肺炎支原體和細菌混合感染，并證實難治性肺炎支原體肺炎中合并細菌感染的情況較少，不應常規聯用多種抗生素，從而減少耐藥機會［19］。

3.2 NGS 用于指導呼吸道非典型病原體感染治療NGS 可通過檢測呼吸道非典型病原體耐藥基因突變及動態監測感染后氣道微生物組等方法指導臨床抗感染治療，也有研究者利用NGS 技術研究非典型病原體感染的致病機制，為探討新的治療方法提供思路。

PARKER 等［20］對含有流感病毒的鼻咽拭子進行NGS 檢測，發現了抗病毒藥物耐藥性的基因組區域，結果與傳統PCR 法完全一致，體現了NGS 在檢測耐藥基因突變上的可靠性。TREBBIEN等［21］對一名免疫低下的甲型H1N1 pdm09 流感病毒感染患者進行為期6 個月的動態監測，在首次奧司他韋治療后NGS 檢測到H275Y 奧司他韋耐藥突變（60.3%），而在第二次扎那米韋治療過程中檢測到H275Y（65.1%）、I223R（9.2%）和E119G（89.6%）等混合耐藥突變。這項研究說明免疫功能低下的流感患者在抗病毒治療過程中可能出現多重耐藥，而NGS 可以在檢測病原體的同時獲取耐藥信息，從而及時調整抗病毒治療方案。值得注意的是，由于目前仍缺少特定耐藥突變基因導致耐藥表型的相關研究，不能關聯耐藥基因與相應的病原微生物，臨床應用NGS 獲取的耐藥基因信息時仍需要結合具體的臨床信息綜合判斷［22］。

HU 等［23］利用NGS 技術對一例致死性H7N9 流感病例的氣道微生物組進行全程縱向研究，發現抗病毒治療3 d 后H7N9 病毒的復制受到抑制，證實了抗病毒藥物的敏感性。同時，鮑曼不動桿菌和革蘭氏陰性菌主導了H7N9 病毒感染后的氣道微生物組，而發病9 d 后經痰和血培養證實患者繼發鮑曼不動桿菌感染。因此，NGS 的動態檢測可以評價呼吸道感染的抗病毒治療效果，并揭示未來可能出現的繼發感染，充分解讀這些信息可能對臨床醫生選擇抗病毒藥物和優化抗生素聯用方案有重要意義，改善患者預后。

因為NGS 的測序深度更高、覆蓋度更廣，所以與傳統PCR 檢測相比，基于NGS 的轉錄組測序可以在樣本量更少的情況下，更全面地描述個體或單細胞在某一特定生理條件下的基因表達情況，有助于研究疾病分子水平上的變化和發現新治療靶點［24］。MAN 等［25］運用NGS 技術進行轉錄組學分析，發現兒童支原體肺炎患者的NK 細胞和CD8+T細胞有過度增殖和活化的現象，且IFNγ、PRF1、GZMB、FASL 和GNL 等細胞因子表達上調，可能在兒童支原體肺炎的發病機制中起重要作用。對呼吸道肺炎支原體感染后的這種免疫功能失調和細胞因子變化進行干預，可能是新的治療思路，但是仍需要更多研究證實。

3.3 NGS 用于呼吸道非典型病原體感染暴發監控和調查KOTHARI 等［26］發現某腫瘤病區有呼吸道副流感病毒感染聚集性病例，利用NGS 技術鑒定了病毒株的親緣關系信息，追蹤傳播途徑，判斷出院內發生了副流感病毒傳播，而這可能是通過醫護人員的互相接觸發生的。CHARPENTIER等［27］在一次卡氏肺孢子菌肺炎爆發中利用NGS 聯合多位點序列分型進行分析，發現NGS 可以對卡氏肺孢子菌株準確分型，描述傳播網絡，并提出這項技術有可能進一步確定病原體感染的可能日期及地點。綜上所述，因病毒和真菌等非典型病原體的分離培養要求苛刻，限制了利用菌株分型進行疫情跟蹤和分析的能力，而NGS 不依賴分離培養的特點使它可以更快捷、更全面地鑒定不同病原體基因型，對管理院內感染、預防傳染等有重要意義。

由于NGS 在病毒株特征分型上的優越性，WHO 已將全球流感病毒的NGS 數據納入監控，作為預測下一季節流感病毒特征的參考，并在2019年基于這些數據分析結果調整了甲型H3N2 流感病毒疫苗的組分［28］。

此外，NGS 還用于環境病原體檢測。自然水環境是軍團菌的主要來源，對淡水系統的軍團菌監測、危害預測和風險評估與人類健康密切相關，NGS 目前也用于評估環境軍團菌群，有研究表明其準確度優于實時PCR 檢測技術［29］。

4 問題和挑戰

NGS 的推廣應用仍有許多問題需要解決。第一，NGS 缺乏大樣本規范化研究證實其可靠性和優越性。第二，缺乏統一的質控標準和規范的測序流程。第三，目前暫無完善的臨床應用指南對解讀NGS 報告進行指導，檢測出微生物并不等于病原體感染，鑒別致病原和背景菌仍是一大難題。NGS 檢測呼吸道非典型病原體也有其局限性，如病毒往往具有較小的核酸序列，且極不穩定、易變異、易降解，尤其是RNA 病毒，需要更高質量的樣本儲存和運輸條件以及更精密的富集策略。而支原體、衣原體、軍團菌等胞內感染致病原和真菌等厚壁微生物的DNA 提取效率低，使序列數和覆蓋率偏低，最終導致檢測敏感度下降。因此，為了在臨床推廣應用，NGS 及其相關配套技術和條件仍需繼續優化［30］。

盡管NGS 的臨床應用面臨著許多問題和挑戰，但它的發展前景是廣闊的。已經有研究者提出了更精密的富集目標微生物核酸和去除宿主核酸策略，可以選擇性裂解宿主細胞并從臨床樣本中分離出特定生物［31］。而MYCROBIOTA 等處理平臺的開發，逐步減少了嵌合體和DNA 污染等造成的偏差，并提供了一個易于使用的生物信息學管道，可以在不需要高級生物信息學技能的情況下實現NGS 結果的自動化解釋［32］。新的測序儀器極大地縮短了測序流程的實際操作時間，可以在24 h 內提供測序結果，而單個樣本的測序成本也從70 美元降低到28 美元［33］。因此，未來NGS 技術也將繼續提高測序準確度、簡化工作流程、優化分析報告和降低成本，實現在臨床上的廣泛應用。

5 結語與展望

目前NGS 檢測呼吸道非典型病原體的研究主要以病例報道和小樣本臨床研究為主，仍有待進一步的大樣本臨床研究對比分析其與傳統檢測手段的敏感度和特異度。NGS 技術在檢測呼吸道非典型病原體中有著巨大的潛力，目前已逐步應用到臨床診斷、治療指導以及暴發調查等方面，對改善患者預后和預防易感人群感染有重要意義。雖然NGS 仍不能完全取代目前常規的非典型病原體檢測技術，但是隨著技術不斷革新和臨床應用逐步規范，NGS 可以作為一種有效的補充手段［34］，為傳統檢測技術難以診斷或治療效果欠佳的病人提供參考，減少不必要的抗生素使用并改善患者預后。同時，NGS 在鑒定新型病原體、指導防疫工作上發揮著不可或缺的作用。在分子病原學診斷技術不斷發展的時代，NGS 將成為精準抗感染治療的關鍵技術。