基于蛋白組學的中醫藥辨治大腸癌的研究概述＊

郭玲建，祝利民

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院 上海 200032）

蛋白質是生命活動的主要承擔者，蛋白質組[1]是依賴于基因組的直接產物，由基因、細胞或組織類型表達的完整蛋白質。蛋白質組學是后基因組時代興起的新技術，以蛋白質組為研究對象，研究在個體發育的不同階段，正常或異常情況下，各種細胞內蛋白質的種類、數量、結構和功能狀態，從而闡明基因的功能。鑒定并研究這些差異蛋白在生命過程中的作用，對疾病防治、藥物開發具有重大意義。

大腸癌包括結腸癌和直腸癌，是全球常見的惡性消化道腫瘤之一，根據美國癌癥協會最新的全球癌癥數據統計[2]顯示，大腸癌在全球癌癥死亡率和發生率中皆居第三位。在我國國家癌癥中心[3]收集的數據表明大腸癌死亡率位居前五，發病率緊隨肺癌、胃癌之后，且發病率呈逐年上升趨勢。大腸癌患者的治療以手術和化療為主，放療、免疫治療、靶向治療和中醫藥治療多種治療手段相結合，其中中醫藥療法貫穿患者治療的全過程，在增效減毒[4]、預防轉移、降低復發率及提高患者生存質量、延長生存期等方面具有良好效果。蛋白組學作為系統生物學的一部分，從微觀研究到宏觀表征，整體的、系統的解析生命過程的研究特點與中醫藥的“整體觀”、“辨證法”、“動態性”的理念不謀而合，使得傳統中醫藥研究能夠以蛋白水平的強大生命科學技術為依托，輸出中醫藥治療大腸癌的“微觀”機理并深入找尋其作用機制反饋于臨床[5-6]。蛋白組學技術運用于中醫證候、中藥作用機制的研究成為趨勢，故本文從中醫學的核心思想“辨證”（中醫證候）、“論治”（中藥作用機制）兩個角度對蛋白組學的大腸癌中醫藥研究進行歸納總結，以期為大腸癌的現代化研究提供參考。

1 中醫證候

證候是指機體正邪斗爭的動態過程中的某一階段的病理體征和主觀癥狀的概括，具有系統性、空間性、時相性[7]的特點。蛋白組學是以細胞或組織不同時間和環境的蛋白質總體為研究對象，在蛋白水平整體地揭示疾病發展過程中蛋白表達的動態變化，這與中醫辨證的核心理念“整體觀”、證候演變的“動態性”極為相似。因此應用蛋白組學技術研究大腸癌證候，有利于闡明其本質，揭示機體病理改變的物質基礎。

1.1 異病同證

從不同疾病的同一證型探索大腸癌是辨證分型客觀化的角度之一。季青等[8]為探索大腸癌和肝癌“異病同證”的物質基礎，分別采集肝腎陰虛證和無證可辨的大腸癌、肝癌患者的血漿并提取蛋白，利用同位素相對標記、iTRAQ 標記和液相色譜串聯質譜聯用技術鑒定，結果顯示大腸癌術后與肝癌術后肝腎陰虛證組共同的差異蛋白有8個。這些蛋白主要與補體和凝血級聯途徑有緊密聯系，KNG1、HBA2 等蛋白可能是大腸癌和肝癌“異病同證”的物質基礎之一。本課題組[9]前期還做了大腸癌與肝癌術后肝腎陰虛證的代謝組學研究，結果顯示二者的共同代謝物是甘氨酸、尿素、色氨酸和丙氨酸，其代謝調控以氨基酸降解為主。

1.2 同病異證

縱向研究同一疾病的不同證候是中醫認識大腸癌的另一角度。徐玉芬等[10]利用雙向凝膠電泳和質譜分析對輔助治療期大腸癌脾氣虛證、胃陰虛證、平和證型患者的血清蛋白質組進行分析，篩選出13個表達有顯著差異的蛋白質，其中血紅素前體、α-1-B-糖蛋白、色氨酸羥化酶-1、結合珠蛋白在胃陰虛證、脾氣虛證患者血清中表達均上調，α-2-糖蛋白1 表達下調，胰蛋白酶抑制劑HI30、轉甲狀腺素蛋白在胃陰虛證患者中表達上調，在脾氣虛證患者中表達無顯著差異。結果表明大腸癌輔助治療期脾氣虛證、胃陰虛證形成存在不同的分子基礎，可作為辨證論治的潛在客觀指標。孫校男等[11]收集了輔助治療期結腸癌濕熱證、脾虛證及無癥狀患者的血清各8 例，進行雙向凝膠電泳及質譜鑒定。結果顯示濕熱證組較無癥狀組維生素D結合蛋白升高，血清結合素前體、β-解離抑制因子（β-GDP）、載脂蛋白A-I前體和簇蛋白均降低。脾虛證組較無癥狀組β-GDP、簇蛋白及血清結合素前體升高，前白蛋白原、載脂蛋白A-I 前體及維生素D 結合蛋白均降低，表明這6 種差異表達蛋白的組合性變化可能是輔助治療期結腸癌的物質基礎。程德金[12]應用iTRAQ 標記定量蛋白質組學技術對健康人及大腸癌脾虛證和濕熱證患者間的唾液蛋白進行定量，結果顯示大腸癌脾虛證患者與健康人間的差異蛋白有378個；大腸癌濕熱證患者與健康人間的差異蛋白有493個；大腸癌濕熱證與脾虛證間的差異蛋白分別有299個、414個，共有的差異蛋白為79個。

1.3 同病單證

對同一疾病單一證候的研究是辨識大腸癌證候分子機制的有效手段。孫校男等[13]收集大腸癌輔助化療期血瘀證、脾虛證及平和質患者血清各8例，進行雙向凝膠電泳及質譜鑒定。結果顯示在血瘀證及脾虛證大腸癌患者中轉移相關蛋白、觸珠蛋白、微管蛋白α鏈3、β-二磷酸鳥苷（β-GDP）、血清載脂蛋白A-I均高表達，凝血酶原、二氫葉酸還原酶樣蛋白質、血管生長因子受體-1、腫瘤蛋白DJ-1 在血瘀證中高表達但在脾虛證中低表達，神經生長因子G-1、白細胞介素-27α 在血瘀證患者中低表達而在脾虛患者中高表達，表明這11 種差異表達蛋白的組合性變化可能是大腸癌血瘀證的物質基礎。周小軍等[14]為從蛋白質水平探討大腸癌濕熱蘊結證的本質，采用雙向凝膠電泳法分離30 例大腸癌濕熱蘊結證患者腫瘤組織和20 名正常人結腸黏膜組織的蛋白質，鑒定出20個差異蛋白。大腸癌濕熱蘊結證與對照組比較，有15個蛋白上調，5個蛋白下調，表明大腸癌濕熱蘊結證患者和健康人的蛋白質表達具有差異，為在蛋白質水平研究濕熱蘊結證本質提供了物質基礎。白玉茹[15]為探尋脾虛濕盛型大腸癌的客觀依據，選取23例經病理確診的脾虛濕盛型大腸癌患者的組織進行iTRAQ 定量蛋白鑒定并進行生信分析和WB 驗證。結果顯示MGST2、RRM2、SRM、GSTT1、GPX3、GSTM3 這六個差異蛋白經WB 驗證與iTRAQ 結果一致，為脾虛濕盛型大腸癌的發生發展機制及相關腫瘤標志物的研究提供了新的線索。

在大腸癌中醫證候的蛋白組學研究中，研究者多以人體血清、組織為樣本進行蛋白質組檢測和生信分析，探索以證候為中心的“異病同證”、“同病異證”、“同病單證”的物質基礎，為大腸癌證候辨識的標準化、客觀化提供量化依據，對指導臨床診療和預后具有重要意義。

2 中藥作用機制

蛋白組學作為后基因組時代興起的新技術，將其引入中藥研究，以蛋白表達差異的直觀方式闡述中藥作用于機體的機制，擺脫“經驗醫學”的桎梏，推動中藥治療疾病的現代化研究。蛋白組學是高通量的信息集合，結合蛋白組學研究大腸癌的中藥治療，有利于尋找中藥作用于大腸癌的位點，更深入的認識其作用機制，應用于臨床實踐。

2.1 中藥復方

陳純輝[16]為觀察大黃?蟲丸是否通過改善肝臟的纖維化狀態來抑制大腸癌的肝轉移，采用無標記比較蛋白組學對MC38-EGFP 細胞在C57BL/6J小鼠體內衍生的外切體進行分析。結果顯示大黃?蟲丸能夠顯著降低肝臟趨化因子2（CCL2）及其受體CCR2 的表達，減少荷瘤小鼠肝臟巨噬細胞浸潤，減輕M2 極化，減少F4/80 陽性面。說明大黃?蟲丸通過抑制CCL2介導的M2 偏斜范式，改善促纖維化微環境，抑制大腸癌肝轉移。

2.2 中藥有效成分

已有報道姜黃素是包括大腸癌在內的多種癌癥類型中的有效化學預防和治療劑，Sato 等[17]為進一步了解其如何發揮抗癌活性，使用SW480和SW620人結腸癌細胞進行蛋白組學分析。結果鑒定出39 種姜黃素調節的磷蛋白，其中5種參與癌癥信號傳導途徑，進一步分析表明mTORC1和p53信號通路是姜黃素的主要靶標。Tai 等[18]使用絞股藍皂苷（GpS）治療Apc(Min/+)大腸癌模型小鼠，證實GpS 可顯著減少小鼠中的腸息肉數量和大小，并進行蛋白組學分析，鑒定了GpS 處理后的40 種差異表達蛋白，這些蛋白大多與細胞氧化還原穩態有關，經WB 驗證了與其有關的Peroxiredoxin-1、Peroxiredoxin-2 的上調及 Raf-1 的下調，還發現GpS 可增強5-氟尿嘧啶（5-FU）的抗癌功效。強調了GpS 作為抗癌藥的潛力及其抗癌的潛在機制，和在結直腸癌化療中作為5-FU 佐劑的作用。雷公藤甲素是一種二萜類三環氧化物，提取自中草藥雷公藤。Liu 等[19]使用蛋白質組學技術研究雷公藤甲素處理的結腸癌細胞，結果顯示雷公藤甲素引起了與細胞周期和凋亡相關蛋白14-3-3 epsilon 的裂解和核周移位，表明雷公藤甲素可能值得作為結腸癌的潛在治療劑進行研究，其抗癌作用可能與14-3-3ε 的改變有關。薯蕷皂苷提取于穿龍薯蕷，是抗結腸癌的有效藥物。Chen 等[20]采用iTRAQ 技術研究薯蕷皂苷處理與未處理結腸癌細胞HCT116，鑒定出288個差異表達蛋白。結果表明薯蕷皂苷誘導結腸癌細胞毒性的分子機制與氧化磷酸化、Wnt、p53和鈣信號通路有關。

2.3 有效成分衍生物

Kim 等[21]為檢測人參皂苷的衍生物-新型人參皂苷(G-Rp1)的抗增殖和促凋亡活性的分子靶標，進行了二維凝膠電泳蛋白質組學分析，結果顯示G-Rp1 明顯上調了結腸癌Lovo 細胞中的SNU-407、DLD-1、SNU-638、AGS、KPL-4、SK-BR-3和Apo-A1的蛋白水平，通過敲除Apo-A1 的小干擾RNA 上調了ADP-核糖和p53 的水平，并抑制了Lovo 細胞的增殖，表明GRp1 可能通過上調Apo-A1 抑制細胞增殖，促進凋亡，從而發揮抗癌作用。雙青蒿素是青蒿素衍生物，Lu等[22]在前期研究中建立了結腸癌細胞HCT116 的雙青蒿素耐藥株HCT116/R，并對HCT116/R 的抗增殖和耐藥特性進行了蛋白組學研究，鑒定出8 個差異表達蛋白，結果表明雙青蒿素可能不會誘導結腸癌的多藥耐藥表型，且為進一步研究其抗癌機制提供了新的線索。

中藥復方抗大腸癌的蛋白組學研究較少，中藥有效成分治療大腸癌的蛋白組學研究是當前熱點，其中青蒿素[23]及其衍生物[22,24]、姜黃素[17,25-28]、雷公藤甲素[19,29-30]的研究較多，同時常見食物提取物[31-36]對大腸癌的“食療”作用也得到了更多關注。

3 小結與展望

蛋白組學的發展為中醫藥認識和治療大腸癌提供了新思路，拓展了新方法，在一定程度上挖掘了中醫藥與大腸癌的科學內涵，促進了中醫藥與現代醫學的匯通，但仍存在不足之處。大腸癌證候的蛋白組學研究多圍繞差異表達蛋白獨立的生物學意義描述，若同時關注差異表達蛋白間的互作關系和多組學聯用探索大腸癌證候的分子機制，不僅將更加貼合中醫學“整體觀”的理念，也將提高證候分型量化標準的可靠性、邏輯性。中藥復方雖在傳統中醫藥的應用中占主導地位，然由于其化學成分復雜、作用靶點多、研究難度大，基于蛋白組學的中藥復方抗大腸癌研究較少，因此可以從有效成分或其衍生物入手，對復方中的主要有效成分進行蛋白組學分析，然后通過生物信息分析等手段整合，以“化整為零-歸零為整”方式運用蛋白組學進行中藥復方抗大腸癌的機制研究，做到“病與藥”的結合。

蛋白組學技術在傳統中醫藥研究中的應用[37]是現有研究手段中的熱點，因此本文系統回顧了蛋白組學在中醫藥抗大腸癌中的主要研究領域。蛋白組技術遠比基因組技術復雜和困難，蛋白質不僅有著復雜的翻譯后修飾，且蛋白組學研究需要制備大量的蛋白質，因此在蛋白質的分離、擴增和純化上還存在一定的難度，仍需完善擁有高通量、高靈敏度、高準確性的研究技術平臺。但隨著蛋白芯片、雙向電泳、蛋白質譜等技術的不斷成熟與使用，蛋白組學技術將在闡明中醫藥防治大腸癌機制上發揮重要作用，尤其是為本課題組下一階段研究中藥作用于大腸癌的機制提供了重要的技術支持。