諾氟沙星對水生生物細胞色素P450作用機制研究進展

王宏偉，崔鐵峰，張蒙，孫梟瓊，方楠

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2. 河北大學 生命科學與綠色發(fā)展研究院， 河北 保定 071002)

自青霉素被成功制成可以抗細菌感染的藥品以來[1]，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素達4 000多種，其中超過153種得到了實際應(yīng)用[2].諾氟沙星(norfloxacin，NFLX)是第3代喹諾酮類抗生素，對革蘭氏陰性菌有較強的殺傷作用.NFLX憑借其諸多優(yōu)良屬性，在醫(yī)療、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用.現(xiàn)今，隨著人們生活品質(zhì)的不斷提高，對水產(chǎn)品的消費越來越多.與此同時，人們對水生生物的抗生素污染情況也越發(fā)重視.在日常接觸到的水產(chǎn)品中，有相當一部分是人工養(yǎng)殖而來，為了預(yù)防和治療細菌性疾病以及加快水生生物的生長和繁殖，在養(yǎng)殖的過程中會人為地向養(yǎng)殖水體中投放一定量的抗生素.因此，深入研究抗生素對水生生物的影響有著十分重要的現(xiàn)實意義.

1 抗生素研究概況及其污染途徑

抗生素的使用為人類與細菌的對抗提供了非常重要的幫助.抗生素雖然不會直接對人體造成傷害，但是對其不合理的使用，尤其是在水體中的過量投放，會加劇耐藥性細菌的產(chǎn)生，從而出現(xiàn)毒副作用[3].

抗生素進入到生物機體后，僅有少量在生物體內(nèi)發(fā)生羥基化、裂解和葡萄糖甘酸化等生化反應(yīng)，成為沒有生物活性的代謝產(chǎn)物，而超過90%的抗生素會不經(jīng)歷任何新陳代謝作用，直接排泄到體外[4].這些養(yǎng)殖過程中過量投放和沒有經(jīng)過代謝的抗生素，一小部分會直接滲透到地下水中，其余都會經(jīng)過地表徑流、污水排放系統(tǒng)等最終匯聚到河流和湖泊之中.現(xiàn)階段常規(guī)水污染處理技術(shù)還很難將水體中的抗生素徹底清除.因此，抗生素在河流和湖泊中形成蓄積性污染[5]，并在水生生物中富集、放大，最終沿著食物鏈影響到人類.

2 NFLX的研究概況

2.1 理化性質(zhì)

圖1 NFLX的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of norfloxacins

NFLX的化學結(jié)構(gòu)如圖1所示，分子式為C16H18FN3O3.NFLX為白色至淡黃色的結(jié)晶粉末[6]，味微苦；難溶于水或乙醇，在二甲基甲酰胺中略溶，在醋酸、鹽酸、煙酸或氫氧化鈉溶液中易溶[5].

2.2 作用機理

NFLX的作用位點為細菌的DNA促旋酶，可使細菌DNA發(fā)生曲旋狀開裂[7]，抑制細菌生長和繁殖，進而達到殺滅細菌的目的.NFLX作為第3代喹諾酮類藥物，具備抗菌譜廣、作用性強的特點，尤其對銅綠假單胞菌、大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌、奇異變形桿菌等革蘭氏陰性菌效果明顯.在實際應(yīng)用中常常使用其乳酸鹽和煙酸鹽[6]，以保證NFLX在動物體內(nèi)得到更好的吸收.

2.3 應(yīng)用現(xiàn)狀

喹諾酮類藥物具有廣譜、高效、毒副作用小以及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)良屬性，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛使用.而NFLX作為喹諾酮類抗菌藥物的代表品種[8]，更是在水產(chǎn)和畜禽業(yè)的實際應(yīng)用中發(fā)揮了極為重要的作用.NFLX對多種水產(chǎn)動物細菌性疾病都有很好的預(yù)防和治療效果.淡水養(yǎng)殖魚類多種常見病如細菌性敗血癥、白頭白嘴病、打印病和爛鰓病的病原菌對NFLX都有很高的敏感度[9].實踐證明NFLX在畜禽體內(nèi)吸收迅速，但并不完全[10].在對鯉魚的實驗中，NFLX在腎臟中的含量高于其他組織，相應(yīng)的消除期更長，而血液中的含量非常低[11].

現(xiàn)如今，抗生素濫用的現(xiàn)象非常嚴重，尤其在亞洲地區(qū)，抗生素的濫用情況占世界的70%，而中國的濫用情況占亞洲的70%[12].在臨床、醫(yī)藥以及水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，也會有大量的藥物直接或間接地進入到水環(huán)境中，長時間作用下就會對生活在其中的水生生物造成抗生素污染.這些仍然具備生物活性的抗生素，即使在痕量水平上，也會對當?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成潛在的威脅[13].

3 細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)的研究概況

3.1 CYP450簡介

CYP450因其在450 nm處有特異吸收峰而得名，主要位于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是一類廣泛分布在生物體內(nèi)的超基因家族，屬于單氧酶的一類.其催化反應(yīng)按照催化難易程度分為典型催化反應(yīng)和復(fù)雜催化反應(yīng)[14].CYP450可以催化內(nèi)源物質(zhì)的合成和降解以及外源物質(zhì)的代謝，可以在解毒代謝階段I發(fā)揮重要作用[15].一般來說，外來物質(zhì)對于CYP450通常表現(xiàn)為復(fù)合作用，即低濃度誘導、高濃度抑制.

3.2 CYP450家族

CYP450是臨床藥物代謝研究的重要對象，涉及藥物代謝的亞型主要為CYP1、CYP2和CYP3家族中7種亞型.其中，CYP1家族中存在CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1這3種亞型；CYP450酶系中最大的家族CYP2包含了CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D和CYP2E共5種亞型；CYP3家族存在4種基因亞型，但是在水生動物研究中應(yīng)用較少[14-15].

在水生生物相關(guān)研究中，CYP450家族中的CYP1A、CYP2B和CYP2E這3個亞家族為主要研究對象.CYP1A與藥物在生物體內(nèi)的相互作用有關(guān)[16]，進一步研究CYP1A在NFLX脅迫下的反應(yīng)，對于分析NFLX對生物的毒理作用有十分重要的意義[17]；CYP2B是在口服藥物作用到生物體后，首先出現(xiàn)過敏效應(yīng)的一類CYP450酶[18].CYP2B可以參與臨床上約60%藥物的代謝過程，具備將有生物活性和難溶的反應(yīng)底物催化反應(yīng)成更加容易排出體外且沒有生物活性的代謝產(chǎn)物的功能，從而發(fā)揮解毒的功能.這一過程對于研究外界藥物在生物體內(nèi)的代謝和排出均有重要意義;而CYP2E不僅在藥物的代謝過程中發(fā)揮作用，也參與到了生物體內(nèi)70余種化學物質(zhì)的代謝過程，如乙醇等.有研究表明[16]，迄今為止研究的所有動物中，它們CYP2E的反應(yīng)底物和人類是相同的.所以研究環(huán)境因素對動物CYP2E的影響對于人類具有一定的參考價值[19-20].

3.3 CYP450的代謝機制

CYP450參與的生化反應(yīng)種類繁多[21]：氧化型CYP450 Fe3+與藥物的復(fù)合作用；接受還原性輔酶II提供的電子，由輔酶II細胞色素C還原酶傳遞，還原為CYP450 Fe2+[22]；CYP450 Fe2+中的低價鐵血紅素蛋白可以結(jié)合分子氧；接受由還原輔酶Ⅱ NADPH提供的或還原輔酶Ⅰ供給的2個電子；釋放離子氧使得藥物氧化，余下的離子氧再與氫離子結(jié)合生成水[23].

3.4 CYP450介導抗性的分子基礎(chǔ)

因為CYP450和藥物代謝密切相關(guān)，所以生物對于某種藥物抗性能力很大程度上取決于相關(guān)CYP450酶的數(shù)量或質(zhì)量.包括cyp450基因擴增、突變以及轉(zhuǎn)錄的增強等，這些都是影響其數(shù)量或質(zhì)量改變的機制.但結(jié)合一些之前的報道，未發(fā)現(xiàn)這種改變伴隨著基因擴增，所以大部分學者更加傾向于是由于1個或者多個基因突變而引起酶的數(shù)量或質(zhì)量變化,而這種突變引發(fā)的具體表象包括CYP450酶的超量表達和氨基酸的替換以及這2種現(xiàn)象的聯(lián)合作用.這些很有可能是CYP450介導抗性的分子基礎(chǔ)[24-25].

4 NFLX對水生生物CYP450的影響

NFLX較強的生物組織穿透力、較高的耐受性和較長的半衰期，使其更容易毒害長期生活在水體中的水生生物.在組織層次上，這種毒害作用會表現(xiàn)得十分復(fù)雜，不利于進行研究分析.CYP450可以從分子水平上很好地指示出NFLX對水生生物影響作用從無到有、由輕到重的過程.

4.1 NFLX對CYP450活性的影響

4.1.1 影響機制

外界污染物進入生物體中的轉(zhuǎn)化過程通常包括2個階段：第1階段在 Ⅰ 相代謝中，首先由CYP450依賴性的混合功能氧化酶(MFO)將親脂性底物氧化，把氧引入到底物分子中；第2階段在 Ⅱ 相代謝中，被氧化的非生物物質(zhì)和內(nèi)源性分子相結(jié)合，形成低毒且易排出的代謝產(chǎn)物.由此判斷，在NFLX長期的誘導和影響下，Ⅰ 相代謝中的CYP450活性可能會有所變化.正因如此，可以根據(jù)測定CYP450活性變化來反映生物體受NFLX的脅迫和影響，進而將CYP450作為一種生物標志物，應(yīng)用到環(huán)境污染的早期評價中[26-27].

4.1.2 檢測方法

在實際操作中，不是直接測定CYP450的活性大小，而是通過測定其同工酶的活性變化來揭示CYP450的活性變化.常用的酶和反應(yīng)如下：7-乙氧異吩噁唑酮-O-脫乙基酶 (EROD)，7-乙氧異吩噁唑酮-O-脫乙基反應(yīng)測定CYP1A活性；氨基比林-N-脫甲基酶( APND)，氨基比林-N-脫甲基反應(yīng)[27]；紅霉素-N-脫甲基酶 (ERND)，紅霉素-N-脫甲基反應(yīng)用來測定CYP2B活性[28]；苯胺-4-羥化酶 (AH)，苯胺-4-羥化反應(yīng)來測定CYP2E活性[29].

研究對象的選取，可以是解毒作用發(fā)生的主要部位如肝臟，還可以是腎臟、肌肉等組織的微粒體.

4.1.3 毒理效應(yīng)

NFLX對中國圓田螺的毒性實驗中[27]，NFLX對田螺CYP450活性的影響存在顯著的時間和劑量效應(yīng)，這種效應(yīng)雖然在不同組織中表現(xiàn)得有所差異，但都有相似性.即在前期，NFLX可能對一些組織的CYP450活性有誘導作用，但到實驗后期,隨著NFLX濃度的升高和實驗時間的延長，誘導作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔茫籒FLX對劍尾魚的毒性實驗中[30]，NFLX對于劍尾魚CYP450活性的影響存在相當大的雌雄差異，同時在雌雄實驗中，兩者均表現(xiàn)出了濃度-效應(yīng)關(guān)系，但不同的CYP450亞酶具體表現(xiàn)不同，以雄魚的CYP3活性為例，在整個暴露過程中都呈現(xiàn)了濃度-效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)出了不同程度的誘導；在NFLX對中國明對蝦的毒性實驗中[31]，各劑量的NFLX對中國明對蝦鰓和血清中CYP450的整體活性呈現(xiàn)抑制作用，且存在一定的時間和劑量效應(yīng)，隨著NFLX濃度升高，鰓和血清中CYP450酶活性受到的抑制作用也越明顯；NFLX對阿部鯔鰕鯱的毒性實驗中[32]，實驗前期CYP450酶活性受到誘導，但在實驗進行到168 h時，阿部鯔鰕鯱肝臟中CYP2B和CYP3A的活性均受到了顯著的抑制.

總體來看，在諸多水生生物實驗研究中，NFLX對CYP450的影響結(jié)果相似，即在實驗前期，NFLX可能對一些組織中的CYP450活性存在誘導效應(yīng)，在實驗的中后期隨著NFLX濃度的不斷提高，NFLX對于組織中的CYP450活性最終表現(xiàn)為抑制作用.對于生活在水體中的水生生物來說，這種隨時間延長而積聚的NFLX對生物體組織中CYP450的抑制作用，不僅會阻礙其對于毒性物質(zhì)的代謝和排泄，而且也會對生物自身的生長和繁殖造成消極的影響.可以想象，這種毒性物質(zhì)累積的作用會伴隨著食物鏈的物質(zhì)流動和累積而不斷地被放大，最終作用到人類自身，危害人類的健康和安全.

4.2 NFLX對cyp450基因表達的影響

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NFLX不僅會直接對CYP450的活性造成影響，還會對其基因的表達調(diào)控有影響[33].NFLX的長期作用，可以影響CYP450正常的mRNA存量，從而干擾CYP450相關(guān)基因的正常表達.

4.2.1 檢測方法

對于cyp450基因表達情況的檢測，常用的方法是實時熒光定量PCR法(quantitative real-tiwe PCR,qPCR).通過qPCR檢測在NFLX脅迫下CYP450相關(guān)mRNA的相對表達量，利用EROD活性和CYP1AmRNA表達量存在正相關(guān)關(guān)系[30]這一特點，同時檢測EROD酶的活性大小，研究NFLX對cyp450基因表達的影響.EROD的活性大小，可以采用熒光分光光度計測定，探針可以使用7-羥基-3-異吩噁唑酮(RF)等.

4.2.2 毒性效應(yīng)

結(jié)合之前NFLX對劍尾魚的實驗可知，NFLX對于劍尾魚肝臟中CYP450酶系中Ⅰ相、Ⅱ相代謝酶活性與mRNA相對表達量的效應(yīng)具有一致性[30]，這證明了NFLX的添加確實影響了CYP450酶系中cyp1a基因的表達,而這種影響在雌雄體之間差異明顯.以雄性個體為例，高濃度NFLX對雄魚肝臟中cyp1a基因的表達有誘導作用，而且表現(xiàn)出一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系；NFLX對阿部鯔鰕鯱的實驗[32]，結(jié)果顯示，在各個暴露時間段，CYP1AmRNA的表達量總體受到誘導并且呈現(xiàn)出“鐘形曲線”的變化趨勢，即隨著NFLX濃度的增加，CYP1AmRNA的表達量先是受到誘導，后來隨著NFLX濃度的提高誘導的程度有所下降；在NFLX對牙鲆的毒性實驗中[33]，發(fā)現(xiàn)CYP450的一些同工酶的活性明顯受到抑制，同時qPCR結(jié)果表明，NFLX抑制了CYP450部分基因的表達.

這些都表明NFLX對于cyp450基因表達的影響存在一定的時間和劑量效應(yīng)，而且這種效應(yīng)在雌雄個體之間有著顯著差異.這種對于CYP450酶系非正常的干擾作用，會造成生物體代謝功能紊亂，影響細胞和組織對外源物質(zhì)正常的代謝，加劇抗生素藥物或有毒物質(zhì)在生物體中的累積.

5 總結(jié)

現(xiàn)階段研究人員探究NFLX對CYP450酶系的影響主要有以下表現(xiàn)：在微觀水平，研究對象由酶層面(蛋白質(zhì))到轉(zhuǎn)錄層面(mRNA)再到基因?qū)用?DNA)；在宏觀水平，從實驗生物的生長發(fā)育到各個系統(tǒng)組織生物活性再到不同器官的生理狀態(tài)已經(jīng)做了比較全面和細致的工作.研究表明，NFLX對于水生生物體內(nèi)CYP450酶系的影響可以從2個方面來實現(xiàn)：一方面是在CYP450酶發(fā)生作用的效應(yīng)階段，即Ⅰ相代謝中，直接影響氧化代謝中CYP450酶活性,在長期的作用下，NFLX通過抑制CYP450酶在生物肝臟、腎臟和肌肉等組織的活性，削弱了生物體代謝及排泄有毒物質(zhì)的能力，更容易造成有毒物質(zhì)在生物體中的積累；另一方面，NFLX在cyp450基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，對DNA轉(zhuǎn)錄出的mRNA的量有所影響，通過干擾mRNA的量來影響翻譯的CYP450酶的量，進而影響CYP450酶系酶的總活性，最后使得生物體代謝有毒物質(zhì)的能力發(fā)生變化，影響生物整體的生長、發(fā)育和繁殖.宏觀上，這種影響作用經(jīng)過生物鏈不斷的累積和放大，最終對整個生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的危害.

CYP450酶系組織結(jié)構(gòu)龐大，涉及多種不同的生化過程，同時生物體內(nèi)存在其同工酶，這種機制會緩沖NFLX對于生物的毒性作用.現(xiàn)階段的研究多集中于CYP450酶系在藥理學免疫調(diào)節(jié)活性中的關(guān)鍵作用，而對于作為毒性物質(zhì)的指示指標，相關(guān)研究還不夠系統(tǒng)和完善，毒性物質(zhì)的濃度和各個酶之間的對應(yīng)關(guān)系還不夠明確和清晰，不足以單獨作為一種指標來衡量毒性物質(zhì)對于生物的毒害作用.隨著人們對抗生素污染的不斷重視和相關(guān)針對性的研究進一步深入，相關(guān)的數(shù)據(jù)變化進一步對應(yīng)和量化，此后CYP450酶系可以作為一種更加快速準確反應(yīng)毒性損傷的指標，用來直觀地表現(xiàn)NFLX等抗生素對于生物的毒害作用.