百合新病原菌假短孢彎孢生物學特性及其對殺菌劑的敏感性

李潤根 盧其能 何咪

摘要 假短孢彎孢Curvularia pseudobrachyspora是我國新記錄種，首次在龍牙百合貯藏期腐爛鱗莖上發現，并能引起龍牙百合葉斑病。為明確其生物學特性及其對藥劑的敏感性，研究了不同碳源、氮源、pH、光照、溫度等處理對病原菌菌絲生長的影響，并采用菌絲生長速率法測定該病原菌對9種殺菌劑的敏感性。研究表明，最適合菌絲生長的碳源為麥芽糖和木糖，氮源為牛肉浸膏，pH為7.0～8.0，最適溫度為30℃，致死溫度為52℃，黑暗條件有利于菌絲生長，病原菌可以侵染馬鈴薯、甘薯、薺菜，不能侵染蒜、蔥。在9種參試殺菌劑中，1%申嗪霉素SC對該病原菌的毒力最高，相應的抑制中濃度EC50為0.012 mg/L;68%精甲霜·錳鋅WG的毒力最低，EC50為15.820 mg/L。

關鍵詞 百合; 假短孢彎孢; 形態特征; 生物學特性; 藥劑敏感性

中圖分類號： S 436.44

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019414

Abstract Curvularia pseudobrachyspora is a new record in China. It was found for the first time on the rotten bulbs of Longya lily during storage and could cause the leaf spot of Lilium brownii var. viridulum. The biological responses of the pathogen to different carbon sources， nitrogen sources， pH and light treatments were also studied. The results showed that the most suitable carbon sources were xylose and maltose; the most suitable nitrogen source was beef extract; the optimum temperature for the mycelium growth was 30℃，and the mycelium lethal temperature was 52℃; the optimum pH for the mycelium growth was 7.0-8.0， and the suitable light condition for the mycelium growth was 24 h dark. The sensitivity of the pathogen to nine fungicides was tested， and the results showed that the inhibitory effects of six fungicides on the mycelium growth of the pathogen were significant. The fungicide shenqinmycin 1% SC had the strongest inhibitory effect among the fungicides tested， with an EC50 value of 0.012 mg/L. The fungicide metalaxyl-M·mancozeb 68% WG had the minimum inhibitory effect， with an EC50 value of 15.820 mg/L.

Key words Lilium brownii var. viridulum; Curvularia pseudobrachyspora; morphological characters; biological characteristics; sensitivity to fungicide

百合Lilium spp.在中國栽培歷史悠久，其具有作為花卉的觀賞價值，而地下鱗莖又可食用，營養豐富，藥用價值突出，屬藥、食兼用型植物，因此有著很高的開發利用價值[1]。龍牙百合是我國三大食用百合之一，在江西、湖南、廣西等地廣泛栽種，取得了較好的經濟效益。但是龍牙百合是一種較易感病的作物，特別是連作時病害嚴重。隨著龍牙百合栽培面積的不斷擴大，病害發生越來越多，已經成為百合產業發展的重要問題之一[2]。已有報道，江西田間百合種植的主要病害有鐮孢枯萎病、疫病、灰霉病、炭疽病、病毒病和葉斑病等26種[3]。

百合葉斑病為百合葉點霉Phyllosticta lilicola Saccarda引起[3]，截至2017年尚未見彎孢屬真菌引起百合葉斑病的相關報道。2017年，假短孢彎孢Curvularia pseudobrachyspora最先在泰國的牛筋草Eleusine indica上被發現[4];2018年，筆者在龍牙百合貯藏期腐爛鱗莖上發現該彎孢菌，并證明它能引起龍牙百合鱗莖腐爛和葉斑病[5]，是我國新記錄種，NCBI登錄號分別為：MH819562（ITS1/4）、MH822836（TEF1-α：EF1-983F/EF1-2218R）、MH822837 （GAPDH）、MN061051（LSU：LROR/LR5）和MN061045（18S：NS1/NS4）。為進一步掌握假短孢彎孢的生物學特性和室內篩選適宜的防治藥劑，為有效防治百合葉斑病提供理論基礎，特進行本試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌假短孢彎孢C.pseudobrachyspora為本實驗室于2017年10月分離自江西省萬載縣高城鎮綠泉合作社冷庫（0～4℃）貯藏的龍牙百合Lilium brownii var. viridulum的腐爛鱗莖，病原菌已進行形態學與分子鑒定。

室內抑菌試驗供試藥劑及生產廠家見表1。

1.2 假短孢彎孢形態特征觀察

將分離純化獲得的菌株轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）上，置于25℃培養7 d。觀察菌落整體形態特征，并挑取生長旺盛的菌絲制成玻片，在顯微鏡下觀察分生孢子和分生孢子梗形狀，測量孢子大小，觀察產孢量和產孢特性;采用常規的玻片培養法，25℃下培養7 d，觀察并記錄分生孢子的著生狀態并拍照。

1.3 假短孢彎孢生物學特性

1.3.1 病原菌生長溫度和pH測定

將直徑5 mm的病原菌菌塊接種到馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato saccharose agar，PSA）平板培養基中央，設置5、10、15、20、25、30、35、40℃等8個不同培養溫度處理。以PSA為基礎培養基，用0.1%的NaOH和HCl溶液調配pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的培養基，25℃培養。

1.3.2 光照對病原菌生長的影響

將直徑5 mm的病原菌菌塊接種到PSA平板中央，25℃培養，光照條件分別為連續光照、連續黑暗、L∥D=12 h∥12 h光暗交替和自然光照。

1.3.3 適宜病原菌生長的培養基碳、氮源篩選

以查氏（Czapek）培養基為基礎培養基，以KNO3為氮源，碳源總質量濃度為12.63 g/L，選擇6種不同的碳源：乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉，用不加碳源作對照。以蔗糖為碳源，氮源總質量濃度為0.33 g/L，選擇11種不同的氮源：硝酸鈉、精氨酸、酵母浸膏、氯化銨、天冬酰胺、硝酸銨、硝酸鉀、尿素、硫酸銨、牛肉浸膏、蛋白胨，以無氮源培養基為對照。兩種處理均25℃培養。

1.3.4 病菌致死溫度測定

將直徑5 mm的病原菌菌塊放置于裝有1 mL無菌水的滅菌離心管中，分別置于45～75℃（設置梯度5℃）的恒溫水浴中處理10 min（先預熱1 min）后取出迅速冷卻。將處理過的菌塊置于PSA平板培養基中，25℃恒溫培養，連續觀察7 d。先以相隔5℃梯度確定致死溫度范圍，然后相隔1℃設置梯度重復以上試驗，確定菌絲致死溫度。

1.3.5 病原菌對不同作物的致病性

取自大田的馬鈴薯、薺菜、甘薯、蒜、蔥等作物的健康葉片，用流水沖洗后，70%乙醇消毒30 s，再用2%次氯酸鈉消毒5 min，切取適宜長度用無菌濾紙吸干水分，放在事先滅過菌的墊有濾紙的培養皿中，背面朝上，每皿放3片，保濕培養，將菌餅接種在葉片背面，以接種無菌PSA塊為對照，置于25℃恒溫培養箱中培養，觀察葉片被浸染的情況。

所有處理均設4次重復。

1.4 假短孢彎孢對殺菌劑的敏感性

選用9種藥劑（表1）對病原菌進行室內毒力測定，采用菌絲生長法測定其對龍牙百合葉斑病病原菌的抑制作用。經預試驗后，對假短孢彎孢菌絲生長抑制率在5%～95%范圍內的6個質量濃度（精甲霜·錳鋅稀釋1 000、10 000、50 000、100 000、200 000、500 000倍;己唑醇、唑醚·啶酰菌、肟菌·戊唑醇、咪鮮胺錳鹽、腈菌唑、嘧菌酯稀釋1 000、10 000、50 000、200 000、400 000、1 000 000倍;申嗪霉素、抑霉唑稀釋50 000、100 000、200 000、500 000、1 000 000、2 000 000倍），制作含藥介質培養基，藥劑需要在培養基冷卻至55℃以下時加入。將5 mm菌餅接種到含殺菌劑的平板中央，每處理重復3次，以加入滅菌蒸餾水的培養基平板為對照，于25℃下倒置培養，對照處理的菌絲生長直徑大于70 mm后，量取各平板中菌落的直徑，計算抑菌率。將抑菌率換算為幾率值、藥劑濃度換算為對數值進行計算[6-7];利用SPSS 22.0軟件求出毒力回歸方程、相關系數和EC50。

2 結果與分析

2.1 假短孢彎孢形態特征

菌落在PDA平板上呈圓形，中央隆起，初期鋪展生長，顏色為灰色、淡褐色或墨綠色，邊緣和表面一層的菌絲為灰白色;菌落絨狀，生長較快，7～8 d幾乎長滿直徑90 mm的培養皿（圖1a、b）。后期菌絲形成黑色傘形子座（圖1e、f）。分生孢子梗褐色有隔膜， 單生或分支， 頂端直或彎曲。分生孢子2～5個簇生（圖1c、d），淡褐色或深褐色，具有3～4個隔膜，孢子大小和顏色不均勻，中間兩個細胞膨大且顏色較深，兩端兩個細胞較小且顏色淺，從基部向上數第3個細胞最大，顏色最深，向一側明顯彎曲。分生孢子形態多樣，有彎曲、不對稱的彎月狀，直短棒狀，梨形等，分生孢子大小為21.70（13.66～28.32）μm×9.94（5.72～15.00）μm（圖1g）。

2.2 假短孢彎孢生物學特性

不同溫度對假短孢彎孢菌絲生長的影響具有一定的差異（圖2a）。病原菌在10～40℃范圍內均可生長，在20～30℃下生長最快，在40℃時生長極為緩慢，溫度低于5℃時菌落幾乎停止生長。

在7種pH環境下菌絲均可生長，但在不同pH條件下生長速度不同，其中pH為7.0和8.0時最利于菌絲生長（圖2b）。

在供試的7種碳源上菌絲均可生長，但在不同碳源上生長速度不同，其中木糖和麥芽糖最利于菌絲生長（表2）。

與不加氮源的對照相比，各供試氮源除硫酸銨外其他氮源對病原菌菌絲生長均具有顯著促進作用（表3），7 d時各不同氮源下的菌落直徑的大小排序依次為：牛肉浸膏>蛋白胨>精氨酸>尿素>硝酸鈉>硝酸鉀>酵母浸膏>天冬酰胺>氯化銨>硝酸銨>硫酸銨>無氮源對照，以牛肉浸膏為氮源時菌絲生長最快，以硫酸銨為氮源時菌絲生長最慢。在無氮源條件下病原菌雖然能生長但菌絲很稀疏，需要在透射光下才可看見。

不同光照條件下假短孢彎孢菌絲生長有些差異，黑暗條件下菌絲生長較好，優于其他條件，但與光暗交替條件下菌絲的生長差異不顯著（表3）。

假短孢彎孢菌株在溫度45～50℃經10 min處理的菌絲在PSA培養基上均能繼續生長，但在52℃ 10 min和53℃ 10 min處理的菌絲不再生長。表明該菌菌絲的致死溫度是52℃，10 min。

另外，病原菌菌塊接種至馬鈴薯等其他5種植物的葉片后，第7天觀察到馬鈴薯、薺菜的葉片上菌絲生長較旺盛，幾乎長滿葉片，接種葉片呈水浸狀，顯示其可以侵染馬鈴薯、薺菜;甘薯葉片上的菌絲較少，但葉片出現失綠變褐呈水浸狀，而對照組葉片無明顯變化，因此認為此病原菌可侵染甘薯，但不侵染蒜和蔥（圖3）。

2.3 假短孢彎孢對殺菌劑敏感性

室內毒力測定結果表明，9種藥劑對假短孢彎孢菌株均有一定的抑制作用。根據殺菌劑濃度與病原菌菌絲生長程度相關的回歸方程可知，隨著殺菌劑濃度的增加抑制作用增強。根據EC50可知，不同

藥劑之間的抑制作用差異較大。其中1%申嗪霉素SC抑制作用最強，EC50為0.012 mg/L;其次是20%抑霉唑EW，EC50為0.190 mg/L;再次是38%唑醚·啶酰菌WG，EC50為0.277 mg/L;68%精甲霜·錳鋅WG的效果最差，EC50為15.820 mg/L（表3）。

由毒力回歸方程可知，1%申嗪霉素SC斜率值最大，68%精甲霜·錳鋅WG其次，250 g/L嘧菌酯SC斜率值最小，說明假短孢彎孢對申嗪霉素最敏感，對精甲霜·錳鋅較敏感，而對嘧菌酯最不敏感（表3）。

取殺菌劑稀釋50 000倍時的抑菌率進行方差分析。結果顯示，1%申嗪霉素SC和20%抑霉唑EW的抑菌率分別為99.3%和92.3%，兩者有顯著差異，且均極顯著高于其他藥劑。38%唑醚·啶酰菌WG、50%咪鮮胺錳鹽WP、30%己唑醇SC、75%肟菌·戊唑醇WG抑菌效果較好，抑菌率都大于等于70%。40%腈菌唑WP、68%精甲霜·錳鋅WG、250 g/L嘧菌酯SC抑菌效果一般，抑菌率在50%以上;嘧菌酯和精甲霜·錳鋅抑菌效果差，極顯著低于其他藥劑（表3）。

3 小結與討論

本試驗中的病原菌假短孢彎孢與Marin-Felix等[4]研究的病原在形態學上相近，但分生孢子稍小，子座與黃微等[8]報道的彎孢菌的相同。

研究病原菌的生物學特性對掌握病害的發生規律和提出防治措施具有非常重要的意義。在對百合假短孢彎孢的生物學特性進行研究時發現，在 PSA 培養基上 30℃ 培養時，菌絲生長速率大于10 mm/d，因此百合栽培時要在溫暖季節及時防治該病菌。該菌在含有硫酸銨的培養基上生長最慢，有研究表明，百合枯萎病菌Fusarium proliferatum[9]、F.oxysporum[10]和高粱附球菌Epicoccum sorghinum[11]都有類似結果，硫酸銨又屬生理性酸性肥料，本研究也表明，pH為4.0時不利于該菌菌絲生長，生產上施用硫酸銨是否能緩解其發病以及偏酸性土壤能否減輕龍牙百合栽培病害等均有待進一步研究。

目前已報道的彎孢菌屬病原菌主要是新月彎孢Curvularia lunata，該菌是一種單子葉作物的兼性病原菌，引起玉米葉斑病、高粱葉枯病、大麻葉斑病、甘蔗幼苗枯萎病[12]、水稻葉斑病[13]、溫郁金葉斑病[14]，也有報道引起辣椒葉斑病[15]、再力花葉枯病[16]等。假短孢彎孢是我國新記錄種，試驗表明，該菌不僅侵染百合（單子葉作物），還能侵染馬鈴薯、甘薯、薺菜等雙子葉作物，對其他作物致病情況有待進一步研究。

菌絲生長速率法測定結果表明，選用的9種殺菌劑對假短孢彎孢菌絲生長都有一定的抑制作用。1%申嗪霉素SC在EC50、毒力回歸方程斜率和抑菌率等方面均表現效果最好，徐輝[13]在水稻彎孢葉斑病防治試驗中也發現申嗪霉素防效較好，申嗪霉素是由熒光假單胞菌M18經生物培養分泌的一種抗菌素，具有廣譜、高效、安全的特點，能有效控制真菌性根腐和莖腐，其作為一種新型微生物源綠色農藥，對百合鐮刀菌枯萎病[9]、百合米根霉腐爛病[17]等均防效良好，推薦百合生產中選用;咪鮮胺錳鹽對于彎孢霉的抑菌效果較好，與黃嫻等[18]對溫郁金彎孢霉葉枯病病原菌的藥劑篩選結果相似。本試驗也首次得出申嗪霉素和抑霉唑對于彎孢菌具有較好的抑制作用。室內毒力測定結果只能說明該殺菌劑在室內離體條件下對百合假短孢彎孢有一定的殺菌活性，而田間防治效果受很多因素的影響，因此在應用于大田防治前還需進一步的田間試驗證實其效果。

參考文獻

[1] 李琦，馬忠明. 施肥對食用百合植株氮磷鉀分布、鱗莖產量和品質影響的研究進展[J].中國土壤與肥料， 2018（5）：8-14.

[2] 葉世森，林芳，宋建英.百合病害的研究綜述[J].西南林學院學報，2005，25（3）：84-88.

[3] 唐祥寧，游春平，劉福春，等. 江西百合病害調查與鑒定[J].江西農業學報，1997，9（4）：1-8.

[4] MARIN-FELIX Y， SENWANNA C，CHEEWANGKOON R， et al. New species and records of Bipolaris and Curvularia from Thailand [J]. Mycosphere，2017，8（9）： 1556-1574.

[5] ZENG Huilan， LI Rungen， LU Qineng，et al. First report of bulb rot on lily caused by Curvularia pseudobrachyspora in China [J/OL].Plant Disease， 2019， https：∥doi.org/10.1094/PDIS-05-19-0943-PDN.

[6] 檀根甲，祝建平.殺菌劑生物測定計算方法及應用[J].安徽農學通報，1998，4（1）：27-28.

[7] 朱茂山，關天舒，呂振環.13種殺菌劑對百合枯萎病菌的室內毒力測定[J]. 農藥， 2010，49（10）： 760-761.

[8] 黃微，夏花，高必達.水稻新病害葉鞘黑斑病的病原鑒定[J]植物病理學報，2014，44（3）：225-231.

[9] 李潤根，程華，張鵬，等. 百合枯萎病菌Fusarium proliferatum的鑒定、生物學特性及抑菌藥劑篩選[J]. 基因組學與應用生物學，2018，37（9）：3844-3851.

[10]曹興，劉南南，胡燕佩，等. 百合鱗莖腐爛病病原菌的鑒定及生物學特性研究[J]. 河南農業科學，2018，47（12）： 96-101.

[11]曾慧蘭，盧其能，曾鵬遠，等.百合葉尖干枯病病原菌的鑒定、生物學特性及其對殺菌劑的敏感性研究[J].園藝學報，2018，45（12）：2407-2416.

[12]LANISNIK R T， WHEELER M H. Melanin biosynthesis in the fungus Curvularia lunata （teleomorph： Cochliobolus lunatus） [J]. Canadian Journal of Microbiology， 2003， 49（2）： 110-119.

[13]徐輝.水稻彎孢葉斑病病原鑒定及流行學研究[D].合肥：安徽農業大學，2015.

[14]CHEN Xuyu， SUI Chun，GAN Bingchun， et al. First report of Curvularia leaf blight on Curcuma wenyujin caused by Curvularia clavata in China [J].Plant Disease， 2013，97（1）： 138.

[15]裴月令，孫燕芳，馮推紫，等.首次鑒定報道新月彎孢引起辣椒葉斑病[C]∥陳萬權.綠色生態可持續發展與植物保護—中國植物保護學會第十二次全國會員代表大會暨學術年會論文集，北京：中國農業科學技術出版社，2017.

[16]歐克芳.再力花葉枯病病原菌鑒定[J]. 江蘇農業科學，2015，43（9）：164-165.

[17]李潤根，艾芬婷. 龍牙百合軟腐病病菌-米根霉的分離鑒定及殺菌劑室內毒力測定初報[J].中國植保導刊，2017， 37（11）： 10-14.

[18]黃嫻，陳旭玉. 溫郁金彎孢霉葉枯病病原菌的藥劑篩選[J]. 安徽農業科學，2014，42（8）：2345-2346.

（責任編輯：田 喆）