PWL基因家族在黑龍江省水稻稻瘟病菌中的分布與變異

孟峰 靳學慧 張亞玲

摘要 根據已公布的PWL家族基因序列設計4對特異性引物，對329個采自2016年及2017年黑龍江省各稻區的水稻稻瘟病菌單孢菌株DNA進行PCR擴增與序列分析，研究了水稻稻瘟病菌中PWL家族基因的組成及變異特征。結果顯示，PWL2與PWL4在黑龍江省各稻區稻瘟菌中均有分布且穩定存在，出現頻率分別為73.86%與73.25%;PWL3出現頻率為40.73%;PWL1在329個菌株DNA中均未擴增出目的條帶，再次驗證了PWL1在水稻的稻瘟病菌中顯示為完全缺失。對部分菌株的PCR產物進行測序分析發現，PWL2、PWL3和PWL4基因編碼區在黑龍江省水稻稻瘟病菌株中的主要變異為點突變，且引起氨基酸的突變。

關鍵詞 黑龍江省; 水稻稻瘟病菌; PWL基因家族

中圖分類號： S 435.111.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019432

Abstract Four pairs of specific primers were designed based on the published sequences of the PWL gene family. The DNAs of 329 isolates of rice blast fungi isolated from different rice regions in Heilongjiang province in 2016 and 2017 were used as templates to amplify and sequence the target genes by PCR. The composition and variation of the PWL gene family in rice blast fungi were studied. The results showed that PWL2 and PWL4 were distributed and existed stably in all rice areas of Heilongjiang with an occurrence frequency of 73.86% and 73.25%， respectively. The frequency of PWL3 was 40.73%. The target band of PWL1 could not be amplified from 329 strains， confirming that the PWL1 gene was completely deleted in the rice blast fungi tested. Sequencing analysis of the PCR products of some strains showed that the main mutations of PWL2， PWL3 and PWL4 genes in physiological races of rice blast in Heilongjiang were point mutations with abundant mutation sites leading to amino acid mutations.

Key words Heilongjiang province; Magnaporthe oryzae; PWL gene family

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae B.Couch引起的稻瘟病是世界水稻生產中最具有毀滅性的病害之一[1-2]，稻瘟病菌變異快，導致抗病品種應用3～5年后便“喪失”抗性，變為高度的感病品種。稻瘟病系統是一個經典的基因對基因系統[3]，只有在稻瘟病菌的無毒基因與寄主的抗性基因相互作用時，水稻品種才能表現出抗瘟性[4]。據不完全統計，目前已有12個無毒基因被克隆，包括PWL2、PWL1、AVR-Pita、ACE1、Avr1-CO39、AvrPiz-t、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pik/kp/km、AVR-Pi9、PWL2D和AVR-Pib[5-14]。其中PWL1、PWL2屬于PWL基因家族，該家族包含4個成員，PWL1、PWL2、PWL3和PWL4[6]。PWL2是最早被克隆的稻瘟病菌無毒基因[5]，有很強的寄主特異性。PWL1來源于龍爪稷病原菌WGG-FA40，也有寄主特異性，氨基酸序列與PWL2有75%相似[5]。PWL3和PWL4在正常情況下是沒有功能的，分別與PWL2有51%和57%的同源性，PWL4要在PWL1或PWL2的啟動子啟動下才會表現出阻止侵染畫眉草的功能。而PWL3在彎葉畫眉草中無毒功能喪失。PWL家族編碼的蛋白有以下共同特征：末端甘氨酸序列具有真核生物序列的共同特征，均是親水性蛋白且甘氨酸位點在整個蛋白中均勻分布。穆慧敏等[15]對PWL1、PWL2、PWL3和PWL4進行分布與變異的分析，結果顯示PWL家族的主要變異為缺失，并且具有豐富的擴增多態性;張崎峰等[16]對2006年黑龍江省19個稻區204個稻瘟病菌菌株的DNA進行PCR擴增，結果顯示PWL2出現頻率為52.94%，PWL3出現頻率為0。張科等[17]對2015年黑龍江省7塊田中采集的124個稻瘟病菌菌株DNA進行PCR擴增檢測，結果表明PWL2出現頻率為72.8%，PWL3出現頻率為66.7%。本研究結合PWL家族的基因擴增與測序結果，對黑龍江省2016年及2017年不同稻區的水稻稻瘟病菌進行分析，研究不同菌株中PWL家族的分布與變異情況。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2016年和2017年在黑龍江省10個市19個縣水稻種植區內采集稻瘟病穗頸瘟標樣，經單孢分離獲得單孢菌株329個（2016年127個菌株，2017年202個菌株）（表1）。

1.2 稻瘟病菌基因組DNA提取

將分離的稻瘟病菌單孢菌株于PDA培養基上培養，取適量菌絲塊放在酵母液體培養基中，于28℃搖床，120 r/min 振蕩3～5 d，將菌絲體分別置于1.5 mL離心管中，使用真菌DNA提取試劑盒（D3390-01 Omega Bio-Tek公司）提取稻瘟病菌基因組DNA，微量分光光度計測定DNA濃度，并將DNA原液稀釋成60 ng/μL的工作液備用。

1.3 引物設計

于NCBI上查找PWL1、PWL2、PWL3基因序列，在CDS區設計3對特異性引物，PWL4引物序列參照穆慧敏等[15]的CDS區序列。4對序列均委托上海生工生物工程技術有限公司合成（表2）。

1.4 PCR擴增及電泳檢測

PCR反應體系（20 μL）：rTaq酶0.1 μL，dNTPs 1.6 μL（各2.5 mmol/L），10×Buffer（Mg+）2.0 μL，正反向引物各0.3 μL，DNA模板1 μL，超純水補足20 μL。擴增程序：94℃預變性3 min;94℃變性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸30～90 s，32個循環;72℃延伸10 min，4℃保存待檢測。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳150 V，20 min，電泳液為 0.5×TBE，在電泳成像系統下拍照并統計無毒基因出現頻率。

1.5 無毒基因的基因序列測序分析

在黑龍江省2016年和2017年的稻瘟病菌菌株中挑選包含所有地區的部分菌株（60株）送上海生物工程技術有限公司測序，測序結果采用DNAMAN軟件對核苷酸的序列進行比對分析，并通過MEGA7軟件對PWL家族構建系統發育樹以確認變異類型。

2 結果與分析

2.1 PWL家族在黑龍江省稻瘟病菌生理小種中的分布

以水稻稻瘟病菌329個菌株的DNA為模板，根據PWL家族序列設計的引物（表2）來進行PCR檢測（圖1）。結果顯示，PWL1在所有供試DNA中均未檢測到目的片段，頻率為0;PWL2在243個DNA中檢測出目的片段，出現頻率為73.86%;PWL3在134個菌株DNA中擴增出目的條帶，出現頻率為40.73%;PWL4在241個DNA中檢測到目的條帶，出現頻率為73.25%（表3）。

2.2 PWL家族基因的序列分析

2.2.1 PWL2基因的序列分析

從243個擴增出目的條帶的菌株中挑選涵蓋所有地區的20個菌株測序。將測序的PWL2序列與已克隆的PWL2序列比對，結果顯示，20個菌株的PWL2堿基序列可分為5類，第一類與已克隆的PWL2基因序列完全一致;第二類與已克隆的基因序列比對有1處差異，即268（A/G），本試驗將該種類命名為PWL2-1;第三類與已克隆的序列比對有4處差異，即64（T/G）、65 T（插入）、268（A/G）、398（T/G），將該類命名為PWL2-2;第四類與已克隆的序列比對有3處差異，即142（T/A）、143 T（插入）、268（A/G），本試驗將其命名為PWL2-3;第五類與已克隆的序列比對差異較大，有16處差異，52（G/T）、65 T（插入）、99 C （缺失）、107（G/A）、108（G/A）、150（G/T）、151（A/T）、152（A/T）、154 G（插入）、220（T/A）、221 C（插入）、223（T/C）、224（T/C）、225（A/G）、228（A/G）、229 A（插入），將該類命名為PWL2-4（圖2）。

PWL2的5類堿基所翻譯氨基酸與已克隆的氨基酸序列比對結果見圖3，PWL2-1序列存在一處錯義突變，即90（Y/D）;而PWL2-2與PWL2-4均在22位處開始出現突變，PWL2-3在49位處出現突變，PWL2-2、PWL2-3、PWL2-4均導致翻譯提前終止。

2.2.2 PWL3基因的序列分析

從134個擴增出目的條帶的菌株中挑選涵蓋所有地區的20個菌株測序。將測序得到的PWL3與已克隆的PWL3序列比對。結果顯示，20個菌株的PWL3堿基序列可分為5類，一類為與已克隆的PWL3基因序列完全一致;其他4類其差異主要體現在305 T（缺失）、367（A/G）、404（C/A）、412（A/C）、413（T/G）和415（G/C）。其中有堿基的差異和上述6處差異相同，本試驗命名為PWL3-1;第三類與PWL3-1相比在167位處增加了堿基C的插入，本試驗將其命名為PWL3-2;第四類與PWL3-1相比又增加了6處差異，即155 A（插入）、161 G（插入）、162 A（插入）、163（C/A）、167 C（插入）和184 C（插入），本研究將其命名為PWL3-3;第五類與PWL3-1相比又多有4處差異，即155 A（插入）、162 A（插入）、163（C/A）、167 C（插入），本試驗命名為PWL3-4（圖4）。

PWL3的5類堿基序列所翻譯氨基酸與已克隆的氨基酸序列比對結果見圖5，PWL3-1在101位處出現移碼突變導致后面氨基酸發生變化;PWL3-2在57位處發生突變導致后面均發生變化;PWL3-3在52位處發生移碼變異導致后面氨基酸均發生變化;PWL3-4氨基酸在52位處發生移碼突變，但在57位處發生同義突變，在101位處再次發生移碼突變導致后面氨基酸均發生變化。

2.2.3 PWL4基因的序列分析

從241個擴增出目的條帶的菌株中挑選涵蓋所有地區的菌株20個送去測序。將測序得到的PWL4與已克隆的PWL4序列比對。結果顯示，20個菌株的PWL4堿基序列可分為3種類型，且與已克隆的PWL4基因序列均有多處差異，其主要差異有42處，其中第一類與這42處差異相同，本試驗命名為PWL4-1;第二類與PWL4-1相比除了42處共同差異外又增加了一處，即在54位處堿基G的缺失，本試驗命名為PWL4-2;第三類與PWL4-2相比增加了一處變異，即在58位處堿基C的缺失，本試驗命名為PWL4-3（圖6）。

PWL4的3類堿基所翻譯氨基酸與已克隆的氨基酸序列比對結果見圖7，PWL4-1、PWL4-2和PWL4-3氨基酸序列均在18位處發生移碼突變導致后面氨基酸發生變化。

2.3 PWL家族進化分析

黑龍江省稻瘟病菌PWL家族變異類型的系統發育樹表明，15個基因型共分為2大支系，一個支系為PWL1、PWL2、PWL2-1、PWL2-2、PWL2-3、PWL2-4，其親緣關系較近;另一個支系為PWL3、PWL3-1、PWL3-2、PWL3-3、PWL3-4、PWL4、PWL4-1、PWL4-2、PWL4-3。其中PWL3與PWL4-1、PWL4-2、PWL4-3的親緣關系要近于PWL4（圖8）。

3 討論

探索無毒基因在自然菌株群體中的分布，可以了解稻瘟病菌群體中菌株的組成及變異特點[18]。本研究通過對329個單孢菌株DNA進行PWL家族的PCR擴增，結果顯示，PWL1在329個菌株中均未檢測出目的條帶，與穆慧敏等[15]研究結果一致，PWL1僅存在于牛筋草來源的稻瘟菌菌株中，而在分離于水稻的稻瘟病菌中表現為完全缺失;PWL2出現頻率為73.86%，且在黑龍江省各稻區均有分布;PWL3出現頻率相對較低，為40.73%;PWL4在黑龍江省各地區也都有分布，出現頻率為73.25%。

病原菌無毒基因不穩定，常常引發變異，變異機制主要包括缺失、插入、點突變、復制、移碼突變等[19]。據報道PWL家族旁側序列的DNA重結合常導致PWL基因的異位、缺失、復制或倒位[6]。因此，PWL 家族的基因序列經常發生變異。穆慧敏等[15]采用12對特異性引物對來源于水稻的28株菌株檢測到PWL2、PWL3和PWL4基因18種類型;余歡等[20]研究發現PWL2基因上游出現多位點現象，PWL3基因上游出現插入類型，PWL4基因上游和下游區域出現了部分缺失。本試驗主要針對PWL家族基因的編碼區進行PCR擴增與序列比對分析，結果發現，PWL2檢測出5種基因型（2、2-1、2-2、2-3、2-4）;PWL3也檢測出5種基因型（3、3-1、3-2、3-3、3-4）;PWL4檢測到4種基因型（4、4-1、4-2、4-3）。研究結果表明PWL 家族基因編碼區的主要變異類型為點突變，且變異位點豐富。但新變異類型能否影響無毒功能的喪失還需進行致病性的測定來驗證。

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（責任編輯：田 喆）