海南省蔬菜根結線蟲發生種類與分布

李周容 龍海波 孫燕芳

摘要 2014年-2018年，對海南省蔬菜根結線蟲病害進行了田間隨機采樣調查和病原種類分子鑒定。結果顯示，蔬菜根結線蟲病在海南18市縣均有發生，且大部分旱田連作地塊病株率達到80%以上。進一步對采集的295份根結線蟲樣本種類進行了分子鑒定，共鑒定出象耳豆根結線蟲、南方根結線蟲和爪哇根結線蟲3種病原種。其中，象耳豆根結線蟲單一檢出率達到62.37%，南方根結線蟲單一檢出率為23.39%，爪哇根結線蟲的檢出率僅為576%，象耳豆根結線蟲和南方根結線蟲復合侵染檢出率為8.47%。除五指山市樣本以外，海南其余17市縣樣本均檢測到象耳豆根結線蟲侵染為害。本研究顯示象耳豆根結線蟲為海南省蔬菜上的優勢病原根結線蟲種類，該結果對指導品種布局、制定根結線蟲病害的防治策略具有重要意義。

關鍵詞 海南; 根結線蟲; 蔬菜; 發生種類; 分布

中圖分類號： S 436.3

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019440

Abstract A systemic investigation of the root-knot nematodes （Meloidogyne spp.） occurring on vegetables in Hainan province was conducted during 2014-2018. The results showed that root-knot nematodes are commonly found in all 18 cities and counties of Hainan province， and the rate of diseased plant was exceeded 80% in most of continuous cropping uplands. A total of 295 samples were collected and assayed for presence of Meloidogyne spp. M.enterolobii， M.incognita and M.javanica were detected at incidences of 62.37%， 23.39% and 5.76%， respectively. In addition， 8.47% samples were M.enterolobii and M.incognita mixtures. Moreover， M.enterolobii was widely distributed in 17 out of 18 counties/cities in Hainan province. These results indicated M.enterolobii now become the predominant specie in vegetables in Hainan， which is helpful for making proper strategies of root-knot nematode diseases control.

Key words Hainan; root-knot nematode; vegetable; species; distribution

根結線蟲Meloidogyne spp.是全球農作物生產上重要的病原物之一，危害包括蔬菜、果樹和糧食作物在內的3 000多種植物[1-2]。目前，國際上已報道的根結線蟲有100余種，其中經濟上最為重要，分布最為廣泛的主要有南方根結線蟲M.incognita、爪哇根結線蟲M.javanica、花生根結線蟲M.arenaria、北方根結線蟲M.hapla和象耳豆根結線蟲M.enterolobii等5種病原根結線蟲[3]。在我國，北方溫帶地區蔬菜上最常見的為南方根結線蟲和北方根結線蟲，而南方熱帶亞熱帶地區最常見的有南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲和象耳豆根結線蟲[4-5]。

海南省地處熱帶，冬季露地蔬菜種植面積近20萬hm2，是我國重要的南菜北運基地。陳綿才等[6]2001年對海南主要蔬菜基地抽樣調查結果表明，幾乎所有瓜類、茄果類和豆類蔬菜均遭受根結線蟲危害，鑒定種類主要為南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲，其中南方根結線蟲為優勢種。近些年來，隨著種植年限不斷增加和重茬連作，海南蔬菜根結線蟲危害日趨加重，且象耳豆根結線蟲已發展成為主要的病原根結線蟲種類[7-8]。為進一步明確海南蔬菜根結線蟲發生及其分布， 2014年-2018年對海南蔬菜根結線蟲進行了田間采樣調查和種類鑒定，以期為根結線蟲病害綠色防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 取樣調查

2014年-2018年，對海南省18個市縣（除三沙市以外）的冬季瓜菜主產區進行隨機取樣調查，每田塊調查10株根系，統計發病率。將具有“根結”癥狀的病根編號，標注采集信息帶回實驗室分離根結線蟲。

1.2 線蟲分離

將病根表面泥土清洗干凈，置于1%食用色素亮藍液中浸泡染色1 min[9]，隨后用清水輕輕沖洗去掉染色液，在解剖鏡下挑取卵囊和雌成蟲。雌蟲用于會陰花紋的制作和DNA的提取，卵囊接種于感病番茄（品種為‘特級大明星）上進行種群活體保存。

1.3 線蟲DNA提取

參照萬新龍等[10]所描述的方法，略有修改。挑取單雌蟲置于含有10 μL滅菌雙蒸水的PCR管中，點動離心后放入液氮中速凍30 s，用滅菌玻璃棒將雌蟲研磨破碎。加入8 μL10×PCR Buffer（TaKaRa），2 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕彈混勻后在PCR儀中65℃溫育90 min，接著95℃保溫10 min。樣品于13 000 r/min離心1 min，取其上清液用于PCR擴增或者于-20℃保存備用。

1.4 線蟲SCAR標記特異性引物擴增

利用根結線蟲的SCAR標記引物擴增特異性條帶，其中南方根結線蟲MiF/MiR引物（5′-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3′/5′-ACGAGGAACATACT-

TCTCCGTCC-3′）退火溫度為62℃[11];爪哇根結線蟲MjF/MjR 引物（5′-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3′/5′-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3′）

退火溫度為60℃[11];象耳豆根結線蟲MeF/MeR引物（5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′/5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′）退火溫度為58℃[12];花生根結線蟲引物MaF/MaR（5′-TCGAGGGCATCTAATAAAGG-3′/5′-GGGCTGAATATTCAAAGGAA-3′）退火溫度為56℃[13]。擴增總體系為50 L，其中10×PCR Buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，Mg2+ 3 μL， 上、下游引物各1 μL， rTaq 酶0.25 μL，DNA 模板5 μL，滅菌雙蒸水30.75 μL。

2 結果與分析

2.1 海南冬季蔬菜根結線蟲病發生情況

根結線蟲病害在海南冬季蔬菜上普遍發生，18市縣均采集到根結線蟲樣本，受害寄主包括茄科、豆科、葫蘆科和十字花科在內的多種瓜菜和葉菜（圖1）。在發病率上，蔬菜連作田（旱地/坡地）高于稻菜輪作田（水田），大部分連作地塊株發病率達到100%，而稻菜輪作田發病率均低于50%（表1）。

2.2 根結線蟲種類分子鑒定

通過提取采集的各根結線蟲種群單雌蟲DNA，結合利用不同種類根結線蟲的特異性引物，共鑒定出象耳豆根結線蟲、南方根結線蟲和爪哇根結線蟲3種根結線蟲。表2為本研究根結線蟲代表性種群的鑒定結果。利用象耳豆根結線蟲特異引物（MeF/MeR）擴增，DZ5、SY7、WC3和LG3種群獲得長度約為300 bp的單一條帶（圖2a）;HK3、SY9、WC5和WC6種群獲得南方根結線蟲特異性條帶，長度約為900 bp（圖2b）;利用爪哇根結線蟲特異引物（MjF/MjR）擴增，僅DA5種群獲得長度約為500 bp的單一條帶（圖2c）。此外，利用花生根結線蟲特異引物（MaF/MaR）擴增，所有種群均無條帶（圖2d）。

2.3 不同種類根結線蟲的檢出率

由表3可知，總共鑒定295份根結線蟲樣本，象耳豆根結線蟲和南方根結線蟲分別有184份和69份（不包含混合發生種群），檢出率分別為62.37%和23.39%。爪哇根結線蟲的檢出率僅為5.76%。此外，象耳豆根結線蟲和南方根結線蟲混合發生的樣本檢出率為8.48%。

2.4 不同種類根結線蟲分布區域

由表3可知，象耳豆根結線蟲在海南各市縣廣泛發生分布，除五指山縣采集的樣品以外，其余17市縣均檢測到象耳豆根結線蟲的寄生為害。南方根結線蟲在海口、文昌、澄邁、儋州、昌江、三亞和定安等7個市縣發生分布。而爪哇根結線蟲僅在定安和五指山有檢出。

3 討論

由于獨特的熱帶氣候條件，根結線蟲在海南無越冬休眠期，造成世代重疊現象普遍。根結線蟲一旦發生，在短時間內可大量繁殖累積，并持續危害造成作物重大產量損失，嚴重時可達80%以上[6]。本研究在海南全省范圍的調查發現，根結線蟲除了危害葫蘆科、茄科和豆科蔬菜等高感寄主以外，還擴散至葉菜類蔬菜，表明根結線蟲病危害范圍不斷擴大，已成為海南蔬菜產業可持續性發展不可忽視的限制因子。而水稻-蔬菜輪作田病株率明顯低于蔬菜連作地塊，表明水旱輪作是防治根結線蟲病害非常有效的農業措施，在條件允許的情況下，可采取水旱輪作制度，降低土壤中根結線蟲基數，從而減輕病害的發生。

本研究共鑒定出象耳豆根結線蟲、南方根結線蟲和爪哇根結線蟲3種根結線蟲危害海南冬季蔬菜。其中，象耳豆根結線蟲檢出率超過60%，已取代南方根結線蟲成為蔬菜上的優勢根結線蟲種類。象耳豆根結線蟲具備高度致病性和極其廣泛的寄主范圍，被國際公認為是最具危害性的病原根結線蟲種類[14]。目前，生產上廣泛應用的番茄（Mi）和辣椒（N）抗性品種，主要對南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲具有抗性作用[15]。象耳豆根結線蟲能夠克服Mi和N基因介導的抗性反應，在抗性辣椒和番茄品種上侵染和快速繁殖，而且至今仍然缺乏對該線蟲有效的抗性品種資源[16]。因此，象耳豆根結線蟲比南方根結線蟲和爪哇根結線蟲等種類具有更好的寄主適應性和種間競爭優勢，這也很可能是其快速擴散并演替成為優勢種類的原因之一。

當前，海南種植戶生產上對蔬菜根結線蟲的防控主要依賴化學農藥，例如辛硫磷和二嗪磷等毒性較高的殺蟲劑。但是，長期單一使用化學農藥導致農藥殘留、環境污染和抗藥性等問題突出，不符合現代生態農業的發展需求。本研究結果明確了海南蔬菜根結線蟲種類及其分布，對于指導農戶采取適宜的輪作制度、品種布局等綠色防控措施具有重要的指導意義。在此基礎上，還需進一步結合輪作倒茬[17]、土壤陽光消毒[18]、生物熏蒸[19]和生防菌劑[20]等有效措施綜合防控根結線蟲危害，從而確保海南蔬菜產業的健康發展。

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（責任編輯：楊明麗）