高效液相色譜法檢測茶葉中摻雜蔗糖的含量

韓蓉?周丹

本文用反相高效液相色譜檢測茶葉中蔗糖的含量，將茶葉中的蔗糖用純水提取，離心，通過0.45μm的濾膜過濾脫氣，流動相為水和乙腈（30：70），流速為1.0mL/min，色譜條件為ZORBAX Carbohydrate;色譜柱4.6mm×250mm，粒度5μm;柱溫40℃;示差折光檢測器。采用標準曲線法，得到的標曲曲線線性關系良好，適合于茶葉中蔗糖的檢測。

茶葉味苦、甘，微寒，入心、肺、脾經。茶葉有清熱降火、祛風解暑的作用。治療外感風寒引起的頭痛、鼻塞，可以用茶葉跟生姜、白芷配伍[1]。風熱上擾引起的頭目昏痛，可用茶葉跟川芎、薄荷配伍。中暑引起的頭痛、煩躁、口渴，可以用茶葉跟西瓜皮同用。茶葉還有解毒、止瀉痢的作用，對于急性細菌性痢疾、慢性細菌性痢疾的急性發作，可以把茶葉研磨沖服。急性腹瀉、下痢不止，可以把茶葉和生姜水煎服。痔瘡出血，可以把茶葉炒焦存性，米湯送服。

近年來，蔗糖添加在茶葉（特別是紅茶）生產中時有發生[2]。茶葉加工中所添加的蔗糖一方面可在香氣、色澤等方面影響對成茶的感官品質評判;同時，由于蔗糖易吸潮、易變質和易滋生細菌等特點，對茶葉質量安全有較大的影響。目前，對于基質簡單的食品中糖類成分樣品檢測可選方法相對較多;但對于基質較復雜的食品（如茶葉等）樣品中的蔗糖檢測，由于基質復雜，直接檢測干擾太多，很難直接檢測出蔗糖含量，一般需先分離干擾基質再檢測，多采用液相色譜法。茶葉中含有各種糖類，是構成茶葉滋味的重要成分之一[3]。在進行茶葉加工的過程中，糖類發生非酶促褐變作用，生成醛和吡咯，對形成茶葉的色澤和香氣有重要影響。部分可溶性糖是影響茶湯是否醇正的主要影響因素。《食品中還原糖的測定方法》等文章介紹了檢測分析糖類的成分的幾種方法，這些方法存在一定的弊端，如時間長，定量測定不準，耗時耗力，無法自動化操作，實驗儀器昂貴使用不便等。隨著我國定量分析測定技術的提升，高效液相色譜法（HPLC）發展成為糖類檢測中最有效的方法[4]，能將多種糖類逐一分離進行分析，能將物質中糖類含量準確地進行定性定量分析，成為糖類分析最重要最準確的方法之一。目前我國已廣泛使用高效液相色譜法（HPLC）分析食品中的糖類。

1.材料與方法

1.1儀器

高效液相色譜儀LC1260 安捷倫科技有限公司，示差折光檢測器 安捷倫科技有限公司，ZORBAX Carbohydrate柱 4.6mm×250mm.粒度5um，默克密理博純水機，美國貝克曼離心機，超聲脫氣機，梅特勒電子天平

1.2試劑

蔗糖標準品、乙腈、蒸餾水

1.3 實驗材料

市售茶葉

1.4色譜柱的前處理

用已配制好的水和乙腈（30：70）緩沖溶液過0.45μm的濾膜超聲處理之后脫氣，以1.000mL/min的流速洗柱12h 保持柱溫40℃。

1.5 色譜條件

流動相：水和乙腈（30：70），流速為1.0mL/min

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate柱 4.6mm×250mm.粒度5μm，柱溫40℃

示差折光檢測器

進樣量：20μL。

1.6標準樣品的配制

1.6.1蔗糖標準儲備液（20mg/mL）：

稱取蔗糖標準品0.2g（精確至0.0001g）于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，濃度為20mg/mL，有效期一個月，4℃冰箱保存。

1.6.2蔗糖標準使用液：

分別吸取蔗糖標準儲備液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.5mL、5mL于50mL容量瓶中，用水定容。分別相當于：0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL濃度標準溶液。分別進標準溶使用液系列各20μL，進行HPLC分析，然后以峰面積為縱坐標，蔗糖的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，化學工作站完成，建立校正表[5]。

1.6 樣品前處理及檢測

取市售茶葉5g加20mL水，超聲30min，靜置，待冷卻后取上清液于離心管中，以4000r/min離心10分鐘，取上清液于50mL容量瓶中，重復一遍，合并上清液。然后用0.45μm濾膜過濾后脫氣待測。取蔗糖樣品20μL進樣檢測峰面積。

2.結果與分析

2.1 線性回歸方程和檢出限

通過對標準樣品和茶葉樣品的進樣，得標準樣品色譜圖，標準曲線圖和茶葉樣品色譜圖。其中，檢測限是分析物蔗糖的信噪比為 3（S/N=3）時所對應的濃度。結果表明，蔗糖的檢測線性回歸方程的相關性良好，檢出限為 0.10 g/100 g。

其中Y為峰面積，X為濃度（mg/mL） 將樣品峰面積Y代入公式求X，可以得到茶葉中蔗糖的濃度C。

2.2結果計算

X=c×V/（m×10）

式中：

X---試樣中蔗糖的含量，單位（g/100g）;

c---由標準曲線查的試樣進樣液中蔗糖的濃度，單位（mg/mL）;

V---試樣定容體積，單位（mL）;m---試樣質量，單位（g）;10---換算系數。

結果保留三位有效數字。

如圖所示，疑似摻糖茶葉蔗糖含量為1.918g/100g，自制摻糖茶葉蔗糖含量為2.303g/100g，秀水天香茶葉蔗糖含量為0.378g/100g，武當山茶葉蔗糖含量為0.377g/100g。其中自制茶葉加糖前后蔗糖含量對比明顯。秀水天香茶葉與武當山茶葉受海拔、土壤、光照及降水[6]等種植條件的影響，蔗糖含量明顯高于自制茶葉。

2.3回收率實驗

以秀水天香綠茶為綠茶的基質，在最優條件下進行 3 個水平的加標回收試驗，每個

水平重復 6 次，按 1.6 方法處理，加標結果分別見表 4。結果表明，蔗糖的回收率在 87.9 %～98.6 %之間，RSD %在 1.33 %～2.14 %之間。

3討論

3.1流動相及流速的選擇

水和乙腈（30：70）體系對蔗糖有較好的溶解度和選擇性，和別的雜質有較好的分離度。選擇流速時，對峰形對稱性有影響[7]，由于液相色譜的柱長250mm，柱徑4.6mm已經確定，就須選擇與之柱子匹配的流量，一般對于250mm、4.6mm、5μm的填料最佳流量為1.000mg/min。

3.2色譜柱的選擇

本次實驗采用安捷倫ZORBAX Carbohydrate 糖分析專用柱。糖分析柱具有重現性好、高效和使用靈活的特點。 每一批這種特殊用途的氨基丙基柱填料都要經過分離單糖和二聚糖的測試。這個色譜柱采用ZORBAX多孔硅膠微球技術[8]。糖分析柱可進行大體積進樣，4.6 x 150 mm色譜柱可以進樣50 μL。

3.3適宜溫度

實際分析中改變柱溫對液相色譜的分離選擇性，分離速度，流動相黏度，柱前壓等均會產生影響。色譜柱溫太高，流動相黏度降低，有利于增大柱的通透性，可加快分析速度，可在一定程度上提供分離選擇性，但是會降低色譜柱的使用壽命，一般設置溫度為室溫，本實驗設置溫度為40°

3.4 定性定量方法

以保留時間進行定性，通過對比試樣中具有與純物質相同保留值的色譜峰[9]，來確定試樣中是否含有蔗糖及在色譜圖中的保留位置。此實驗用外標法進行定量，在一定的色譜條件下，檢測器的響應信號，即色譜圖上的峰面積與進入檢測器的濃度成正比，這是蔗糖定量的基礎，對樣品進行定量有歸一化法，外標法和內標法;歸一化法要求對樣品中所有組分全部出峰，由于該方法使用的標準試劑是分析純，含有的雜質較多，有歸一化法定量將產生較大的誤差。內標法的準確度較高，但對于每個試樣的分析，都要先進行2次稱量[10]，不適合大批量樣品的快速分析。外標法配置一系列標準溶液進行色譜分析，外標法不使用校正因子，準確度較高，但操作條件變化對準確性影響較大，適用大批量試樣的快速分析，因此本實驗采用外標法進行定量。

3.5 注意事項

由于流動相是分析純其中雜質較多[11]，使一些譜圖出現前伸峰;柱溫的不穩定這些因素導致蔗糖的保留時間有所差別，在精度要求的范圍內均影響不大。本實驗采用外標法[12]進行定量，確定了RP—HPLC與其它物質的最佳分離條件，此方法準確度較高適用于大批量試樣的快速分析，適合于茶葉中蔗糖含量的測定[13]。

3.6 結論

利用本實驗方法，對本地綠茶100批次的檢測，得出蔗糖含量在5%～1%之間的樣品，為可疑摻糖樣品，含量在1%以上的，可以基本確定摻雜了蔗糖。

參考文獻

[1] 杜鵬編譯.果蔬汁飲料工藝學.北京：農業出版社，1992，10： 40-42

[2] 王玉君等.高效液相色譜法分析色酒中有機酸的研究.色譜[J].1991，9（4）：51-55

[3] 朱亦人 張仲華 普敏莉.水處理技術 2000 26（5）

[4] 彭奇均 徐玲 孫培東等 色譜[J]2001 16（1）

[5] 中華人民共和國農牧漁業部部標準果汁測定方法 .發布 2.14—1998

[6] FSPYLGS005 果蔬汁飲料 總D-異檸檬酸的測定 紫外分光光度法

[7] 陳蘭化 馬蓮芳? 動力熒光淬滅法測定檸檬酸的研究? 分析實驗室[J] 2005 02

[8] 葉青 阻抑催化動力學光度法測檸檬酸 食品工業科技[J] 2006，11 （3）

[9] 岑海燕，何勇，張輝，馮鳳琴? 可見光/近紅外光譜技術快速測定橙汁檸檬酸含量 光譜學與光譜分析 [J] 2007，9（9）第 27卷

[10] 王爾中 蘇州艾杰生物科技有限公司 發明專利 G01N21/31;C12Q1/26;C12Q1/00

[11] 崔雨林，戴蘊青，韓雅高. 高效液相色譜法測定水果及其果汁中的幾種有機酸[J].北京農業大學學報，1995，21（1）：39-43

[12] 丁明玉等編著.現代分離方法與技術. 北京：化學工業出版社 .2006第1版 113-114

[13] 張祥明編著.現代色譜分析. 上海：復旦大學出版社. 2006，3 第1版 50-51 ， 260