肉桂醇脫氫酶基因研究進展及其在小麥抗倒伏中的應用

盧雯瑩 崔賀云 高杉 崔順梅 吳營照

摘? ? 要：小麥（Triticum aestivuml）是世界上廣泛種植的糧食作物，在逐漸提高小麥產量的同時，高產與倒伏之間的矛盾問題日益顯現。木質素是一種酚類多聚體，它是維管植物細胞壁中不可忽視的重要成分，其在植物中的含量與莖稈是否具有抗倒伏性以及抗倒伏的強弱密切相關。肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質素單體合成途徑下游的一個關鍵酶，大部分植株木質素的總含量會在CAD活性降低或受抑制時隨之降低。本文綜述了肉桂醇脫氫酶基因及其在小麥抗倒伏中的研究進展，有望對小麥肉桂醇脫氫酶基因的克隆表達分析及其對小麥抗倒伏的影響作用奠定基礎。

關鍵詞：肉桂醇脫氫酶;木質素;小麥;抗倒伏

中圖分類號：S512.1? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.10.002

Research Progress of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Gene and Its Application in Lodging Resistance in Wheat

LU Wenying1， CUI Heyun2， GAO Shan1， CUI Shunmei3， WU Yingzhao3

（1.Luohe Academy of? Agricultural Science， Luohe， Henan 462300，China; 2.Luohe Agricultural and Rural Bureau， Luohe，Henan 462300，China;3.Golden Autumn Seed Industry Limited company of Luohe， Luohe，Henan 462300，China）

Abstract： Wheat （Triticum aestivuml） is a widely cultivated crop in the world. The production of wheat is highly increasing in recent years. However， high yield in wheat often causes lodging. Lignin is a phenolic polymer. It is an important component of vascular plant cell walls， and its content in plants is closely related to lodging resistance. Cinnamol alcohol dehydrogenase （CAD） is a key enzyme of downstream about lignin monomer synthesis pathway. The total lignin content of most plants will decrease with CAD activity decreased or inhibited. This paper reviewed the effects of CAD gene on lodging resistance of wheat. It may help the cloning and expression analysis of CAD gene and its further impacts on wheat lodging resistance in the future.

Key words： Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase; Lignin; Triticum aestivuml; anti-lodging

小麥是一年生禾本科作物，在世界范圍內廣泛種植，隨著栽培技術的不斷改進、分子輔助育種技術的不斷發展，小麥生產水平逐漸提高。然而，高產和倒伏之間的矛盾也逐漸凸顯。小麥在籽粒灌漿以后的一段時期容易發生倒伏，倒伏一旦發生，將大大影響小麥產量，一般情況下會導致小麥減產達到10%～30%，嚴重倒伏的可能減產80% 以上[1]。因此，解決小麥的倒伏問題是當前研究小麥品質的重要方向。

木質素與纖維素、半纖維素一起構成次生壁。多位學者的研究表明，植株莖稈強度與相應的木質素含量之間有顯著的正相關關系。因此，通過促進木質素總量的提升或改變木質素單體結構的構成可以提升莖稈抗折力。

木質素的合成路徑較為復雜。在這個合成過程中涉及很多關鍵酶基因和轉錄因子的調控機制。本文選取了木質素單體合成下游中關鍵的還原酶，即肉桂醇脫氫酶（CAD）進行相關論述分析。CAD 在NADP輔酶的作用下將5種肉桂醇（香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羥基松柏醛、芥子醛）還原成相對應的醇（香豆醇、咖啡醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇）。已有研究表明，抑制CAD的活性會降低木質素含量或改變木質素單體結構。

1 肉桂醇脫氫酶基因的結構特征

CAD是醇脫氫酶蛋白，具有兩個保守的結構域：一是醇脫氫酶GroES-like結構域（Alcohol dehydrogenase GroES-like domain），它是CAD酶的活性中心，包括與鋅結合的催化位點和結構位點，而這一結構也是醇脫氫酶家族中所共有的結構;二是Rossmann折疊輔酶結合結構域。除此之外，這個家族中有一個能與底物特異性結合的底物結構域[2]。

在被子植物中，CAD基因在植物生長發育的不同階段由多基因家族編碼而發揮不同作用，這些CAD基因相似性比較高，因此對單個基因功能的鑒定比較困難。高粱CAD6和水稻CAD6在C端都有一個過氧化物體定位信號肽SKL，這在植物中是普遍存在的[3]。水稻的12個CAD基因和桉樹CAD2在NAD（P）/NAD（P）H結構域上存在保守的Ser-212。此外，水稻的CAD2中存在保守的Trp-119和Phe-298[4]，這些證據表明CAD基因在物種進化過程中保持穩定性。馬慶虎等[5]從小麥中分離出一條編碼CAD基因的cDNA，并從小麥EST數據庫中得到其他10個CAD類似基因，連續命名為TaCAD2-TaCAD11。他的研究認為：TaCAD1基因屬于真正的基因家族并參與木質素合成，TaCAD2 和TaCAD4也屬于這一家族，但由于缺乏C末端結構域因而被認為是假基因。TaCAD1的三維結構預測圖與AtCAD5相似，但是在底物結合區域有兩個氨基酸被替換。

2 肉桂醇脫氫酶基因的家族和分類

由于核苷酸和氨基酸序列之間存在差異因而可將CAD基因分成三種類型，其中只有一種類型參與了木質素的生物合成并發揮重要作用，這一類型的CAD在NADP輔酶的作用下將肉桂醇（香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羥基松柏醛、芥子醛）還原成相對應的醇（香豆醇、咖啡醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇）;尚未發現另外兩種CAD類型在木質素合成中發揮作用，有可能是第一種類型的假基因或是參與了其他代謝活動[6]。

許多學者的研究均表明CAD基因是以基因家族的形式存在的，但是CAD基因功能各不相同，有的CAD基因參與木質素生物合成，有的CAD基因與發揮主要作用的CAD基因互相補充共同作用，還有的CAD基因并不發揮任何作用。植物中一些已經被克隆和已研究清楚的CAD基因家族情況如表1所示。

3 肉桂醇脫氫酶基因的研究進展

3.1 肉桂醇脫氫酶基因的克隆

NCBI網站上已經注冊的完整的CAD基因的mRNA有200條左右，包括擬南芥、水稻、小麥、棉花、高粱、毛白楊和茶樹等等。雖然不同種屬的CAD基因家族各有不同，但是在CAD基因系統進化上還具有一定的保守性。NCBI中很多是CAD類似基因，與真正的CAD基因同源性并不是很高，其蛋白結構、酶學特征也沒有完全揭示。

3.2 肉桂醇脫氫酶在木質素合成中的調控

前人研究表明，通過CAD基因的正義和反義表達以及突變體的發生來調整木質素的總含量及木質素單體的比例，目前在楊樹、松樹、高粱、水稻和玉米等植物中均有研究。大部分植株在CAD活性受到抑制時，木質素的總含量會降低;還有一部分木質素總量不發生變化但木質素單體的結構發生改變或發生其他情況的變化，具體見表2。

3.3 肉桂醇脫氫酶基因在轉錄水平上的研究

以上論述已經表明在不同品種植株中CAD基因的功能各不相同，即使在同一植株中，不同的器官、組織和不同的生育時期其表達量也不盡相同。

楊樹CAD基因家族中有19個CAD基因，按照其表達模式的不同可以分成三類：一類在韌皮部、木質部高度表達，二類在根部高度表達，三類在根和頂芽中高度表達。除了表達部位不同外，一二類表達量隨時間推移不斷增加而三類在夏季和秋季的表達量明顯高于春季和冬季[16]。

通過實時熒光定量PCR實驗對擬南芥的9個CAD基因進行表達研究，其中AtCAD2和AtCAD3在木質部中并沒有熒光信號，但是在其根冠和分生組織有表達。AtCAD4和AtCAD5在根中高度表達。此外，AtCAD在花中是高度表達，但在莖中表達量較低[17]。

對小麥TaCAD1基因的功能分析發現，小麥TaCAD1基因在莖稈中高度表達，在葉片中有微量的表達而在根中幾乎不表達，并且與不抗倒伏的品種C6001相比，抗倒伏品種H4564的mRNA表達豐度、蛋白水平和酶活性水平都明顯較高[5]。

不僅如此，CAD基因還與植株生長發育時期相關。枇杷和綠梅在果實不斷成熟的過程中，枇杷EjCAD1和綠梅肉桂醇脫氫酶Pm15的活性和表達量都是在不斷增加的[18]。

3.4 肉桂醇脫氫酶基因的啟動子分析

啟動子是基因的一個構成元件，CAD基因的啟動子可以控制CAD基因什么時候表達，也可以控制CAD基因的表達程度。楊樹中PoptrCAD基因的啟動子有多個組成部分，在白楊不同的生育時期、不同器官和組織中有不同的組分參與調控PoptrCAD基因的表達。同時，在遇到干旱、洪澇、病蟲害等因素脅迫時，該基因可以與Myb、鋅指蛋白等調控因子結合，也可以和ABA、生長素等信號分子結合共同產生應答機制[19]。在甘薯的啟動子研究中也得出類似結論：出現外界作用時，甘薯IbCAD1的啟動子會有明顯的響應機制[20]。

4 肉桂醇脫氫酶基因對小麥抗倒伏性影響的展望

莖倒伏是小麥發生倒伏的主要位置，也是小麥實現高產的主要威脅因素[21]。木質素通過自身交織來使細胞壁加厚，能起到良好的抗壓作用[22]。木質素合成的路徑比較復雜，有很多因素參與調控木質素的合成。在木質素的整個合成過程中參與調控的基因包括苯丙氨酸解氨酶基因（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（cinnamate acid-4-hydroxylase，C4H）、香豆酸-3-羥化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）、咖啡酸O-甲基轉移酶基因（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT）、咖啡酰輔甲基轉移酶A-O酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase， CCoAOMT）、4-香豆酸：輔酶A連接酶（The 4-coumarate： coenzyme A ligase，4CL）、肉桂酰輔酶A 還原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR）、CAD基因等。肉桂醇脫氫酶基因在催化木質素合成途徑中，于木質素單體生物合成的最終步驟發揮作用，這決定了其是不可或缺的關鍵酶之一，其結構和生物學特性的分析將會對小麥抗倒伏性的研究提供理論基礎。

目前，已知的參與植物抗逆的轉錄因子研究成為增強植物抗逆性的重要方向之一，加之分子生物技術已相對成熟，我們可以根據已有的研究基礎，對肉桂醇脫氫酶基因進行生物信息學分析，結合轉錄組數據及ChIP-seq分析，挖掘肉桂醇脫氫酶基因上游調控因子。在大數據背景支持下分析新的與小麥肉桂醇脫氫酶基因共同參與小麥抗倒伏的機制，嘗試是否能夠在某些與木質素合成相關的基因片段等進行編輯處理，研究其相關功能。在基本清楚小麥肉桂醇脫氫酶基因參與木質素合成途徑的作用機制的基礎上，利用分子育種技術實現其在小麥抗倒伏中的應用，有利于培育品質更加優異的小麥品種。

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收稿日期：2020-06-16

作者簡介：盧雯瑩（1994—），女，河南漯河人，研究實習員，碩士，主要從事植物分子生物學研究。