噬菌體防治嗜水氣單胞菌相關疾病的研究進展

成亞輝， 王子藝， 高棟業， 肖 煒， 張仕穎*

(1.云南農業大學 云南省土壤培肥與污染修復工程實驗室，云南 昆明 650201； 2.云南大學 云南省微生物研究所， 云南 昆明 650091)

嗜水氣單胞菌是一種常見的條件致病菌，可引起兩棲動物、爬行動物、鳥類、魚類和其他動物疾病，甚至感染人類[1-3]。過去幾十年，抗生素被普遍應用于治療細菌性疾病感染，但抗生素的不合理使用會導致多重耐藥菌株的出現[4-5]。隨著抗生素的治療效果越來越不明顯，加之成本高、污染環境、抗藥性增加等一系列問題，人們不得不尋找其他可能的替代療法。噬菌體是感染和殺滅細菌的病毒，在環境中分布廣泛。噬菌體的發現最早可追溯到19世紀90年代，英國科學家Ernest Hanbury Hankin發現印度恒河兩岸爆發的霍亂疫情沒有迅速蔓延，并隨時間的推移自動消失，研究后其認為是人們飲用的恒河水中存在某種可以殺滅霍亂病菌的物質。1915年Edward Twort首次報道關于噬菌體的研究，1917年D’Herelle正式提出噬菌體的概念[6-9]。早在噬菌體被發現初期，就被用于治療人類和動物感染的細菌性疾病，即噬菌體治療。D’Herelle提出噬菌體可用于治療細菌感染后，在1919年用噬菌體制劑治愈4名痢疾患者，證實噬菌體治療的價值[10]。20世紀40年代，由于人們對噬菌體生物學相關知識的匱乏，加上青霉素的應用帶來了抗生素的黃金時代，西方科學家逐漸對噬菌體治療的研究喪失興趣，但俄羅斯、格魯吉亞、波蘭等少數東歐國家卻將噬菌體治療沿用至今[6,11]。近年來，由于耐藥菌株的大量出現，抗生素治療效果不盡人意，而噬菌體作為一種天然有效的殺菌劑，具有較高的安全性和有效性，噬菌體治療重新被科學界重視起來[12-15]。鑒于此，從嗜水氣單胞菌的感染、嗜水氣單胞菌噬菌體和嗜水氣單胞菌噬菌體治療等方面對嗜水氣單胞菌噬菌體及其應用研究現狀進行歸納總結，旨在尋找防治嗜水氣單胞菌相關疾病可能的替代方案，并為噬菌體治療的應用奠定理論基礎。

1 嗜水氣單胞菌的感染

1.1 水產動物感染

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)的一種革蘭氏陰性菌[16-17]，在淡水、土壤、食品等環境中分布廣泛。由該菌引起的最常見疾病為運動性嗜水氣單胞菌敗血癥，可引起多種淡水魚類出血性敗血癥、眼球突出、感染性異常水腫和鰭、尾腐爛等癥狀，同時，嗜水氣單胞菌也能感染人類，引起腹瀉、敗血癥等疾病[3,18-19]。1891年，有報道稱嗜水氣單胞菌可導致蛙的“紅腿病”。20世紀80年代，該菌在我國引起魚病大面積傳播，給水產養殖業造成嚴重危害[20]。1986年，又引發腹瀉、敗血癥、食物中毒等疾病頻發[21]。1992年，我國南方各省淡水養殖漁場爆發由該菌引起的敗血癥[20]，次年，在北京爆發了一起嗜水氣單胞菌污染飲用水引起的急性腹瀉，發病率高達65%[22]。2001年，該菌感染導致圣勞倫斯河25 000條鯉魚死亡。2002年，引起印度尼西亞800余t金魚死亡，直接經濟損失近4 000萬美元。2007年和2009年，在美國明尼蘇達州和阿拉巴馬州引發鯰魚養殖場大量污染，損失鯰魚近300萬磅。2010年，韓國水產養殖業出現魚類因感染嗜水氣單胞菌而大量死亡的現象[23-24]。近幾年，泰國養殖的鯰魚也出現大量由該菌引起的出血性敗血癥，死亡率高達80%，經濟損失嚴重[25-26]。

1.2 人類感染

嗜水氣單胞菌不僅對水產養殖業破壞嚴重，對人類健康也存在巨大威脅。2001—2011年，浙江大學附屬醫院從臨床患者腸道外分離的所有氣單胞菌屬中，嗜水氣單胞菌占61.8%[27]。2009—2011年，臺灣一所醫療中心129例由氣單胞菌引起的軟組織感染患者中，77例被確定為嗜水氣單胞菌感染，占患者總數的59.7%[28]。江麗莉等[29]報道了2例由嗜水氣單胞菌導致的壞死性筋膜炎病例。CALLISTER等[30]對幾種蔬菜進行了嗜水氣單胞菌分布和致病性調查發現，其為潛在的致病來源；任超杰等收集15例感染嗜水氣單胞菌病人的分泌物發現，由該菌引起的非腸道感染增多，且該菌具有較高的耐藥率[31]。因此，嗜水氣單胞菌不僅是水產養殖業中的棘手問題，而且嚴重威脅人類生命健康，尋找能夠預防和治療嗜水氣單胞菌感染的有效手段意義重大。

2 嗜水氣單胞菌噬菌體

2.1 嗜水氣單胞菌噬菌體的發現及其基因測序

記錄在NCBI pubmed的第1株嗜水氣單胞菌噬菌體記載于1983年CHOW等[32]發表的關于噬菌體分離和生物學特性的研究。1994年，林業杰等[33]從福建沿海地區外環境標本中分離出25株嗜水氣單胞菌噬菌體，并對其中6株進行鑒定，這是我國首次分離到嗜水氣單胞菌噬菌體。隨著基因工程技術的快速發展，2001年，TETART等[34]完成了第1株嗜水氣單胞菌噬菌體Aeh1的全基因組測序；2012年，SHEN等[35]完成第2株嗜水氣單胞菌噬菌體CC2的全基因組測序，這也是我國首次完成此類噬菌體的基因測序。

2.2 嗜水氣單胞菌噬菌體全基因組序列現狀

截止2020年4月1日，GenBank共收錄44株嗜水氣單胞菌噬菌體的全基因組序列(表1)。這些噬菌體大多從水環境中分離得到，主要來自中國、韓國、波蘭、俄羅斯、美國、澳大利亞和印度7個國家。其中，有23株屬于肌尾噬菌體科(Myoviridae)，占52.3%；12株屬于短尾噬菌體科(Podoviridae)，占27.3%；6株屬于長尾噬菌體科(Siphoviridae)，占13.6%；另有Ahp2屬于絲狀噬菌體科(Inoviridae)，62AhydR11PP和嗜水氣單胞菌噬菌體44572基因組則尚未確定分類地位。已報道的嗜水氣單胞菌噬菌體基因組大小差異顯著，其中肌尾噬菌體科具有較大的基因組，為45～262 kb，且大于200 kb的居多；短尾噬菌體科為30～97 kb，多數為42 kb；長尾噬菌體科基因組大小為45～115 kb；絲狀噬菌體科的Ahp2為47 kb；未分類的62AhydR11PP和 44572基因組大小分別為43 kb和102 kb。從核酸結構看， 44株嗜水氣單胞菌噬菌體中，只有pAh6-C、2L372X、MJG、LAh6和44572為環狀DNA，其余39株均為線狀DNA。

表1 GenBank中可用的嗜水氣單胞菌噬菌體(截止2020年4月1日)

3 嗜水氣單胞菌噬菌體治療的研究現狀

3.1 單一噬菌體治療

由于噬菌體具有較高的宿主特異性和敏感性，不會對正常微生物菌群造成影響[36]，因此，噬菌體療法在嗜水氣單胞菌防治方面具有潛在優勢，在實驗或自然感染的動物中可成功治療嗜水氣單胞菌相關疾病，即使只用單一噬菌體治療，仍有明顯的殺菌效果。研究表明，斑馬魚被感染嗜水氣單胞菌48 h后死亡率達96.67%，經EASWARAN等[37]分離的對致病嗜水氣單胞菌具有強裂解作用的噬菌體pAh-1(MOI=10)處理后死亡率降低50%，證實口服噬菌體pAh-1可大大提高斑馬魚的存活率。為控制由多重耐藥嗜水氣單胞菌引起的鯉科泥鰍大規模死亡，從首爾漢江分離了2株噬菌體pAhl-C和pAh6-C，并評價其在實驗性感染該菌過程中的治療潛力，結果表明，在2.6×106CFU/fish濃度處理下加入pAhl-C和pAh6-C治療，鯉科泥鰍的死亡率從39.17%分別降至17.50%和11.67%；在2.6×107CFU/fish濃度處理下加入pAhl-C和pAh6-C治療，死亡率從100%分別降至26.67%和39.17%，證明噬菌體pAhl-C和pAh6-C能有效預防和治療嗜水氣單胞菌引起的鯉科泥鰍大規模死亡[38]。然而，使用單一噬菌體控制特定病原體，很容易出現耐藥菌株[39-41]，菌株產生抗生素耐受的速度比噬菌體快10倍[42]。JUN等[38]研究發現，雖然噬菌體抑菌效果顯著，但體外抑菌試驗顯示，pAhl-C和pAh6-C分別在12 h和6 h時出現細菌再生現象，說明單個噬菌體用于治療有可能導致耐藥菌株的出現。

3.2 混合噬菌體治療

為了克服單個噬菌體治療有可能導致耐藥菌株出現的局限性，研究者提出噬菌體“雞尾酒”的想法，即將多個不同特性的噬菌體制成混合制劑。越來越多的研究表明，混合噬菌體治療是控制多重耐藥病原體的有效替代方案[39]。LE等[25]分離到對致病性嗜水氣單胞菌具有裂解作用的噬菌體Φ2和Φ5，試驗結果表明，與對照18.3%的存活率相比，使用噬菌體混合制劑處理后(MOI=100)，被試鯰魚的存活率顯著提高，達100%，證實利用噬菌體混合制劑控制嗜水氣單胞菌敗血癥的潛在可能性。但是，噬菌體“雞尾酒”也并不總是比單一噬菌體更有效。HOANG等[26]從鯰魚中分離到4株嗜水氣單胞菌噬菌體，篩選其中2株CT45P和TG25P用于噬菌體治療，結果表明，由2株噬菌體組成的“雞尾酒”能有效抑制細菌增殖，但與單一噬菌體處理相比，噬菌體“雞尾酒”的抑菌效果僅延長1 h左右。導致該現象的原因可能是宿主細菌在接觸噬菌體后會進化出不同的噬菌體抗性機制，而有些噬菌體“雞尾酒”只是不同噬菌體的簡單混合，并沒有考慮噬菌體所吸附細菌的受體差異[43]。因此，考慮噬菌體聯合抗生素治療將會是非常有價值的方法[44-46]。

3.3 噬菌體和抗生素聯合治療

噬菌體和抗生素可通過不同機制完成殺菌，如果二者聯合將可能產生一定協同效應，減少耐藥菌株出現[45]。CHANDRARATHNA等[47]從鯉魚組織中分離出1株噬菌體AHP-1，并比較AHP-1、氯霉素(5 μg/mL)及噬菌體-抗生素聯合治療在體外試驗中的抑菌效果，結果表明，單獨使用氯霉素3 h后觀察到細菌生長，AHP-1在15 h內可抑制細菌生長，聯合治療則在24 h內抑菌效果高于其他2種處理方式；并得出結論，某些情況下低濃度抗生素與噬菌體混合可增強抑菌效果。因此，開發多種噬菌體與低劑量抗生素聯合應用可能具有更好的應用前景。

總體而言，目前關于嗜水氣單胞菌噬菌體的相關研究還不多，只有少數感染該菌的噬菌體進行了生物學特性研究和裂解性分析，其中包括噬菌體pAh1-C、pAh6-C、pAh-1、CT45P、TG25P、AHP-1、Akh-2和LAh1-10[13,26,37-38,47-48]。另外，噬菌體13AhydR10PP、14AhydR10PP、85AhydR10PP和25AhydR2PP有較寬的宿主域，且其基因組中未發現抗性基因和毒力基因[49]，噬菌體MJG、AhSzq-1和AhSzw-1也未檢測到抗性基因或毒力基因[50-51]，這些噬菌體均可作為防治嗜水氣單胞菌相關疾病的潛在藥物，作進一步探索和研究。

4 研究展望

雖然利用噬菌體治療嗜水氣單胞菌相關疾病優勢明顯，但目前成熟的應用研究還相對較少。想要讓噬菌體治療達到最佳防治效果，并將其廣泛應用到臨床治療中，未來還可從以下幾個方面對嗜水氣單胞菌噬菌體開展相關研究：一是篩選更適合用于治療的原始噬菌體，分析噬菌體的生物學特性及基因組信息，了解噬菌體與宿主之間的相互作用方式，考察噬菌體在體外對病原菌的裂解效果，選擇潛伏期短、裂解量高、特異性強、理化性質穩定和突變頻率低的噬菌體作進一步開發利用；二是通過分子生物學手段對噬菌體進行基因改造，隨著分子生物學技術的快速發展，對噬菌體進行遺傳學水平的編輯已成為可能[52]，有研究[53-55]通過基因改造技術將噬菌體的部分基因進行替換，成功改變了噬菌體原有的宿主域，未來可在基因編輯篩選優良性狀方面作更多嘗試；三是制備噬菌體“雞尾酒”，噬菌體“雞尾酒”一般具有宿主域廣、裂解能力強等特性，可克服單一噬菌體抗菌譜窄的劣勢，降低耐藥菌株的出現頻率，是未來噬菌體治療的主要發展方向[40-42]；四是加深對噬菌體殺菌機制的認識，彌補噬菌體治療的不足，噬菌體治療的基本原理是通過裂解宿主細菌達到殺菌目的，目前應用最多的噬菌體裂解酶為內溶素，可對細胞壁進行溶解并釋放毒力因子[11,56-57]，未來這些酶可作為主要成分被用于抗菌性研究中。相信在不久的將來，噬菌體將會憑借其獨特的優勢，成為治療嗜水氣單胞菌相關疾病的另一條有效途徑。