福辛普利對去卵巢骨質疏松大鼠的治療作用和機制研究

裴寶靜，李建燕，辛立杰，郭娜，路靜，王洋，王慶海*

(1.滄州市中心醫院骨二科，河北 滄州 061001；2.河北醫科大學基礎醫學院，河北 石家莊 050017)

骨質疏松癥是一種系統性骨代謝疾病，其特征主要表現為骨量逐漸減少，骨微結構損傷及骨折風險增加等[1]。骨重塑通過成骨細胞調節的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收來維持，當骨吸收大于骨形成時，將會導致骨量減少，引起骨質疏松癥[2]。腎素血管緊張素系統(renin angiotensin system，RAS)的多種生理和病理作用是通過血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)/血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ/血管緊張素1型受體(angiotensin type-1 receptor，AT1R)信號和ACE-2/Ang(1-7)/Mas級聯介導的[3]。RAS在骨骼健康、結構以及新陳代謝之間具有重要作用，研究表明RAS相關成分(如腎素、ACE-1和AngⅡ受體)對局部骨骼重塑過程具有重要作用[4-5]。此外，幾種已知靶向于ACE-2/Ang(1-7)/Mas受體軸介導其作用的藥物包括血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和AT1R阻滯劑，可改善骨密度和骨微結構損傷，對骨質疏松癥治療具有潛在作用[6]。福辛普利是一種ACEI，但對骨質疏松癥的研究較少。因此，本研究探討了福辛普利對卵巢切除術(ovariectomy，OVX)大鼠模型的治療作用及其對RAS/一氧化氮(nitric oxide，NO)信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級SD雌性大鼠(250 ± 5)g購于河北醫科大學實驗動物中心，大鼠隨機分為假手術組、模型組、福辛普利(高劑量組10 mg/kg，中劑量組5 mg/kg，低劑量組2.5 mg/kg)組、陽性對照組(卡托普利40 mg/kg)，每組各10只。所有動物實驗均通過動物倫理委員會的同意和批準。

1.2 試劑與儀器 卡托普利片和福辛普利鈉片均購買于中美上海施貴寶制藥有限公司(上海，中國)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphate，TRACP)試劑盒、骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)試劑盒、鈣測試盒、磷測試盒、NO試劑盒、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(南京，中國)；Anti-AngⅡ抗體購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Dallas，Texas，美國)，AT1R、ACE-1、AT2R抗體均購自Novus Biologicals(Littleton，Colorado，美國)；Micro-CT掃描儀(SkyScan，Kontich，比利時)。

1.3 方法

1.3.1 OVX大鼠模型建立 采用雙側卵巢切除法建立大鼠骨質疏松癥模型，造模前大鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，從大鼠背部脊柱兩側分離并切除雙側卵巢；假手術組僅切除卵巢附近的脂肪組織，術后縫合傷口。手術當周為第0周，連續肌肉注射4 d抗生素(氨芐青霉素，4×104U/d)。

1.3.2 給藥治療 根據文獻報道給藥治療方法[7]，造模8周后開始灌胃給予福辛普利(10 mg/kg、5 mg/kg和2.5 mg/kg)，陽性對照組灌胃給予卡托普利(40 mg/kg)，模型組和假手術組均灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續給藥6周，每周測量1次體重。

1.3.3 子宮臟器系數 大鼠腹主動脈取血，脫頸椎處死，解剖分離大鼠的子宮并稱重，根據公式計算：子宮臟器系數=子宮重量(g)÷體重(100 g)。

1.3.4 骨代謝和骨礦化指標檢測 按試劑盒說明書通過標準比色法檢測大鼠血清中TRACP、BALP活性以及鈣(Ca)和無機磷(P)的水平。

1.3.5 股骨Micro-CT掃描 采用Micro-CT掃描儀分析大鼠股骨近端的骨微結構，分辨率為18 μm。掃描系統于350 ms內以70 kV、85l A和1 000個/180°投影校準。從橫截面圖像中采用CT Analyzer V 1.11.0.0軟件(SkyScan)提取僅包含松質骨的目標體積(volume of interest，VOI)，以進行形態分析。VOI從生長板的下端開始1 mm，向遠側延伸110個橫截面(高2 mm)。對于形態分析，通過3D分析(上述CT分析儀軟件)在松質骨的每個VOI上計算的骨微結構參數，包括骨密度(bone mineral content，BMD)、骨體積分數(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨表面積組織體積比(bone surface/total volume，BS/TV)。

1.3.6 血清NO和NOS檢測 按試劑盒說明書通過標準比色法檢測大鼠血清中NO和NOS的含量。

1.3.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)法 大鼠脫頸椎處死，分離收集實驗大鼠的股骨組織，稱取約30 mg，采用Western Blot檢測大鼠股骨組織中AngⅡ、AT1R、ACE-1、AT2R的蛋白表達水平。根據制造商說明操作提取組織總蛋白，采用二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法對蛋白進行定量，加入Loading buffer(4×)100 ℃煮沸5 min，然后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來達到分離蛋白的目的，電泳條件：80 V，30 min；120 V，60 min。采用100 V，90 min將電泳分離后的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉60 min，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽吐溫緩沖液(tris-buffered saline with tween，TBST)洗滌5次，5 min/次，用一抗(AngⅡ、AT1R、ACE-1、AT2R及β-Actin，按1︰1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，用二抗[辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記山羊抗兔IG，按1︰10 000稀釋]孵育90 min，TBST洗滌5次，5 min/次，用ECL化學發光法顯影檢測，Image J分析灰度值，β-Actin用作內參對照。

2 結 果

2.1 福辛普利對OVX大鼠體重和子宮臟器系數的影響 體重結果表明：與假手術組相比，造模后第3周模型組大鼠的體重顯著增加，持續至實驗結束；從第8周開始給藥，與模型組相比，灌胃給予福辛普利能夠顯著減小OVX大鼠的體重，并呈時間和劑量依賴性(見圖1a和表1)。

表1 大鼠體重變化結果

子宮的臟器系數：假手術組(4.92±0.54)mg/g，模型組(1.11±0.15)mg/g，低劑量組(2.11±0.13)mg/g，中劑量組(3.15±0.50)mg/g，高劑量組(3.85±0.49)mg/g，陽性對照組(3.70±0.42)mg/g。子宮的臟器系數結果表明與假手術組相比，模型組大鼠子宮的臟器系數顯著減小(P<0.05)；與模型組相比，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性增加OVX大鼠子宮的臟器系數(P<0.05，見圖1b)。上述結果表明本研究初步建立了OVX大鼠骨質疏松癥模型，并初步表明福辛普利具有潛在的抗骨質疏松癥作用。

2.2 福辛普利對OVX大鼠血液中骨代謝和骨礦化的影響 骨代謝檢測結果表明與假手術組相比，模型組大鼠血清中TRACP和BALP活性顯著增加，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性顯著減小OVX大鼠血清中TRACP和BALP活性(見圖2a～b)。骨礦化檢測結果表明與假手術組相比，模型組大鼠血清中鈣和磷水平顯著降低，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性顯著增加OVX大鼠血清中鈣和磷含量(見圖2c～d)。上述結果表明福辛普利對OVX大鼠的骨代謝和骨礦化過程具有一定的調節作用(見表2)。

a 大鼠的體重變化情況 b 大鼠子宮的臟器系數

表2 福辛普利對OVX大鼠血液中骨代謝和骨礦化的影響

a 大鼠血清中TRACP活性 b 大鼠血清中BALP活性 c 大鼠血鈣水平 d 大鼠血磷水平

2.3 福辛普利對OVX大鼠股骨近端骨微結構和骨密度的影響 采用Micro-CT分析OVX大鼠股骨近端的骨微結構，并對BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N和BS/TV定量分析。股骨骨微結構圖像表明OVX大鼠在股骨干骺端的所有骨小梁骨微結構參數中均表現出顯著變化(見圖3a)。與假手術組相比，OVX組的骨皮質厚度和骨量減少，小梁骨微結構明顯受損。相反，灌胃給予福辛普利可顯著改善骨微結構損傷，并恢復骨皮質厚度和骨量。與模型組相比，福辛普利治療組大鼠的BV/TV、BS/TV、Tb.N、Tb.Th以及BMD顯著增加(見圖3b～g)，這些結果表明福辛普利能夠改善OVX大鼠骨小梁的骨微結構參數變化和骨微結構受損(見表3)。

a 大鼠股骨近端的Micro-CT分析圖像

表3 大鼠股骨近端骨微結構參數和骨密度值

2.4 福辛普利對OVX大鼠血清中NO和NOS的影響 血清NO和NOS結果表明與假手術組相比，模型組大鼠血清中NO和NOS的含量顯著降低；與模型組相比，灌胃給予福辛普利呈劑量依賴性增加OVX大鼠血清中NO和NOS水平(見圖4，表4)，上述結果表明福辛普利對OVX大鼠血清中NO信號具有調節作用。

表4 大鼠血液中NO和NOS含量

a 大鼠血清中NO水平 b 大鼠血清中NOS水平

2.5 福辛普利對OVX大鼠股骨組織中局部性RAS系統相關分子表達的影響 Western blot結果表明與假手術組相比，模型組大鼠股骨組織中AngⅡ、AT1R和ACE-1的蛋白表達水平顯著上調，同時AT2R的蛋白表達水平下調；灌胃給予福辛普利能夠顯著下調OVX大鼠股骨組織中AngⅡ、AT1R和ACE-1的蛋白表達水平，并上調AT2R的蛋白表達水平(見圖5，表5)，這些結果表明福辛普利對股骨組織中局部性RAS系統具有一定的調節作用。

表5 大鼠股骨組織中局部性RAS系統相關分子表達量

注：與假手術組相比，*P<0.05；與模型組相比，**P<0.05

3 討 論

RAS是一種內分泌系統，主要介導體液和電解質平衡以及血壓方面的功能[7]。但越來越多的研究表明RAS在骨骼系統中具有局部作用[4-6]。本研究發現福辛普利作為一種ACE抑制劑可顯著緩解雌激素缺乏大鼠引起的骨質疏松癥并改善骨微結構損傷，對骨質疏松癥具有潛在的治療價值。

目前，有許多誘發骨質減少和骨質疏松癥的實驗動物模型，但OVX大鼠模型是研究骨質疏松癥的常見動物模型[8]。OVX大鼠的骨質流失與人(尤其是更年期)的骨骼變化相似，因此FDA推薦OVX大鼠作為評價骨質疏松癥潛在治療藥物的模型[9]。雌激素缺乏可引起OVX大鼠的體重增加和子宮萎縮，雌激素是負責性器官如子宮發育的主要雌性激素，并且雌激素通過激活雌激素受體α(estrogen receptor α，ER-α)調節食物需求[10-11]。本研究結果表明與假手術組相比，模型組大鼠的體重從術后3周開始顯著增加，并持續至實驗結束，同時子宮臟器系數顯著減小，上述結果表明本研究初步建立OVX大鼠骨質疏松癥模型，為后續藥物干預研究奠定了基礎。更重要的是，本研究實驗結果表明灌胃給予福辛普利能夠顯著緩解OVX大鼠的體重增加，并增加子宮臟器系數，這表明福辛普利可能對OVX大鼠骨質疏松癥具有潛在的治療價值。

骨代謝生物標志物是骨代謝的有用指標，是監測骨代謝疾病預后和治療效率的有效工具。BALP由成骨細胞產生，有助于骨骼形成，在骨骼重塑過程中都很重要，研究表明BALP代謝水平在骨質流失過程中會增加[12]。TRACP是破骨細胞皺紋邊緣區域發現的一種骨吸收酶，其代謝水平在骨質流失過程中也會顯著增加[13]。本研究結果表明OVX大鼠血清中BALP和TRACP活性顯著增加，這與之前文獻描述是一致的，并且本研究結果也表明灌胃給予福辛普利能夠顯著降低OVX大鼠血清中BALP和TRACP的活性。另外，沉積于骨骼基質的礦物質占正常骨骼結構的50%～70%，骨礦化過程需要骨骼系統與循環系統以及腎臟之間共同實現，并受到大量抑制或促進相關因素的調控[14]。研究表明包括骨質疏松癥在內的骨代謝疾病中的礦物質濃度發生了變化，主要是Ca和P的腎臟清除率升高，導致血清濃度下降，最終引起Ca和P骨沉積受到抑制[15]。本研究表明灌胃給予福辛普利能夠增加OVX大鼠血清Ca和P含量。除此之外，骨密度測量和骨微結構分析是骨質疏松癥診斷的黃金標準。本研究探究了股骨遠端的微環境變化，福辛普利治療OVX大鼠可明顯改善骨微結構損傷，這些研究結果表明福辛普利可能通過影響骨代謝和骨礦化過程對骨質疏松癥產生潛在治療作用。

另外，NO是細胞間與細胞內的一種氣體信號分子，NO主要由NOS催化L-精氨酸產生。研究表明NO和NOS在骨代謝過程中有著重要的作用，基礎濃度的NO對于破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的增殖及基質分泌是至關重要的[16]。有研究表明OVX大鼠血清中NO和NOS含量顯著降低，能夠促進骨吸收并抑制骨形成，最終導致骨質流失并引起骨質疏松[17]。本研究結果表明福辛普利能夠顯著增加OVX大鼠血清中NO和NOS含量。

骨骼局部環境中RAS相關的信號肽、酶和受體均有表達，這表明RAS在骨重塑過程中起著至關重要的作用[18]。本研究中，OVX大鼠股骨組織中經典的ACE-1/AngⅡ/AT1R通路的表達顯著上調，而AT2R表達顯著下調。福辛普利作為ACE抑制劑能顯著下調OVX大鼠股骨組織中ACE-1/AngⅡ/AT1R通路的表達，并且上調AT2R表達。AT2R上調能夠增加骨量，對骨流式相關疾病有潛在治療價值[5]。據報道，ACEI抑制RAS經典的ACE-1/AngⅡ/AT1R信號傳導可改善骨骼結構，并且臨床研究表明可使ACEI治療患者的BMD增加，骨折風險降低[19]。

綜上所述，本研究結果表明福辛普利能夠改善OVX大鼠的體重增加和子宮萎縮，并改善骨代謝、骨礦化過程以及骨微結構損傷。更重要的是，福辛普利能夠調節RAS/NO信號對骨質疏松癥具有潛在的治療價值。但福辛普利是否直接作用于RAS/NO信號，或還存在其他信號通路需要后續研究進一步探究。