基于免疫親和層析和ProteoMiner處理的母乳乳清蛋白質(zhì)組學(xué)分析

靳登鵬，周 雄，劉 煥，楊 嬌，黃卓權(quán)，卜玲玲，柯倩華，柳春紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣東 廣州 510642）

嬰兒期是人類(lèi)一生中十分特殊的階段，其生長(zhǎng)、智力發(fā)育最為迅速，需要特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。在嬰兒的胃腸道發(fā)育、免疫功能等方面，營(yíng)養(yǎng)素發(fā)揮十分重要的作用[2]。 母乳是新生兒最重要的食物，其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、免疫和抗感染因子等都有助于滿(mǎn)足生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵需求[3]，特別是母乳中的蛋白質(zhì)更是與嬰兒的健康、生長(zhǎng)和發(fā)育密切相關(guān)[4-7]。世界衛(wèi)生組織建議在嬰兒出生后的前6 個(gè)月，嬰兒唯一的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源應(yīng)該是母乳，而母乳作為嬰兒營(yíng)養(yǎng)的主要來(lái)源應(yīng)該繼續(xù)持續(xù)1～2 a[8]。但是半歲左右的嬰兒?jiǎn)慰磕溉槲桂B(yǎng)不能滿(mǎn)足其生理需求，必須通過(guò)添加輔食攝取額外的營(yíng)養(yǎng)素和能量[2]，目前一般選擇嬰幼兒配方奶粉作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食物。乳蛋白作為母乳中最主要的成分之一，對(duì)嬰幼兒的健康成長(zhǎng)具有非常重要的作用。

研究[9-11]表明，母乳中的蛋白質(zhì)是由酪蛋白、乳清蛋白、乳脂球膜蛋白和乳外泌體組成。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的人開(kāi)始熱衷于乳清蛋白質(zhì)組學(xué)研究。乳清蛋白是母乳脫脂去除酪蛋白后，上清液中所含有的蛋白質(zhì)，主要含有α-乳白蛋白、蛋白酶、免疫球蛋白等[12-15]，還含有具有重要生物學(xué)特定功能的低豐度蛋白，它主要參與新陳代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種生理及病理過(guò)程[16]。在利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析低豐度蛋白時(shí)，質(zhì)譜中的信號(hào)易被高豐度蛋白所影響，如何除去高豐度蛋白顯得尤為重要。Yamada等[17]通過(guò)免疫吸附的方法除去牛奶中的β-酪蛋白及免疫球蛋白后，發(fā)現(xiàn)了特異的低豐度蛋白質(zhì)；Holland等[18]利用半胱氨酸標(biāo)簽法移除了乳清中的αs1-酪蛋白和β-酪蛋白后，對(duì)其他類(lèi)型的酪蛋白進(jìn)行了分析。

由于母乳中還有大量低豐度蛋白的生理功能尚不清楚，而且國(guó)內(nèi)關(guān)于免疫親和層析和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種方法去除母乳中高豐度蛋白的報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)免疫親和層析和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種前處理方法除去部分高豐度蛋白，富集低豐度蛋白，最后經(jīng)過(guò)LTQ Orbitrp Velos質(zhì)譜儀檢測(cè)，并進(jìn)行相關(guān)的生物信息分析，研究結(jié)果將有助于加深對(duì)人類(lèi)乳蛋白質(zhì)組的了解，為嬰幼兒的健康成長(zhǎng)和疾病預(yù)防提供理論依據(jù)，同時(shí)也可為母乳喂養(yǎng)的保護(hù)作用機(jī)制及有關(guān)乳腺疾病的研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

日齡80～90 d的雌性白兔購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（三水基地），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（粵）2014-0035，體質(zhì)量1.8～2.2 kg。

成熟乳（1 月左右的混合母乳）來(lái)源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，采集于北京地區(qū)的母親。

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、 2-巰基乙醇（均為分析純）、碳酸氫銨（分子生物級(jí)） 天津科密歐試劑有限公司；碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、四甲基乙二胺（均為分子生物級(jí)），乙腈、甲酸（均質(zhì)譜級(jí)），十二烷基硫酸鈉（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；甘氨酸（分析純） 德國(guó)Biofroxx 公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶（質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司； 甲酸（質(zhì)譜級(jí)） 梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ProteinA/G agarose（分析純） 上海翊圣生物科技有限公司；CNBr-活化的Sepharose 4B（分析純） 上海信帆生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒、電泳儀 Bio-Rad中國(guó)公司；LTQ Orbitrp Velos質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；LC-20A高效液相色譜 日本島津有限公司；5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；MDF-192超低溫冰箱 松下電器（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳多克隆抗體的制備

將母乳在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，除去上層的脂質(zhì)層，收集其乳清部分并與完全福氏佐劑乳化（終質(zhì)量濃度4 mg/mL），對(duì)白兔進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射（免疫劑量為1.25 mg/mL），在初次免疫后的第4、6、8周分別以等量的抗原與非完全福氏佐劑乳化，加強(qiáng)免疫后的第10天取血測(cè)效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到105以上時(shí)，心臟取血，得到的兔血在37 ℃水浴中靜置30 min，然后在4 000 r/min離心30 min，吸取上清液，分裝凍存于-80 ℃冰箱中[19]。

1.3.2 母乳多克隆抗體的純化

將血清從-80 ℃取出，待樣品溶解后，過(guò)0.22 μm的聚醚砜濾膜過(guò)濾，收集過(guò)濾后的濾液。取1 mL左右的Protein A/G agarose填料裝入層析柱中，先用5～10 倍柱體積的洗滌緩沖液（0.15 mol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸二氫鉀）洗去殘存的乙醇。將過(guò)濾后的血清反復(fù)上柱孵育，接著用洗滌緩沖液（0.15 mol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸氫二鈉）洗去雜蛋白，再用洗脫緩沖液（0.1 mol/L甘氨酸）洗脫抗體[19]。

1.3.3 母乳免疫親和層析

將純化的抗體在偶聯(lián)緩沖液（0.1 mol/L碳酸氫鈉，pH 8.3）中4 ℃透析并與CNBr-活化的Sepharose 4B偶聯(lián)裝柱。向得到的母乳乳清中加入蛋白酶抑制和氯化鈣溶液，將乳清中氯化鈣濃度調(diào)整成0.06 mol/L，用鹽酸將樣品的pH值調(diào)至4.6[20]，樣品在室溫下孵育1 h。然后4 ℃、13 000×g離心30 min，重復(fù)1 次，收集上清液過(guò)0.22 μm濾膜，樣品在室溫下孵育30 min過(guò)柱，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌出大部分未與抗體結(jié)合的乳清蛋白，收集此階段的溶液作為去除高豐度蛋白的母乳，再用PBS溶液充分洗滌免疫親和柱，待基線(xiàn)洗平時(shí)，用pH 2.4 0.1 mol/L的甘氨酸溶液洗脫與抗體結(jié)合的乳清蛋白，然后平衡及再生免疫親和層析柱[21]。將收集到的樣本透析到PBS內(nèi)，并對(duì)樣本用PEG20000包埋濃縮。濃縮完成后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，驗(yàn)證免疫親和層析的效果。

1.3.4 ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理

母乳樣本經(jīng)過(guò)凍干、復(fù)溶，使樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度達(dá)50 mg/mL以上，參照說(shuō)明書(shū)操作，收集此階段的液體，所得到的濾液經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證效果。

1.3.5 SDS-PAGE分析

每個(gè)樣本取12 μL，加入3 μL的5 倍體積上樣緩沖液，旋渦混勻，在沸水中水浴5 min，10 000×g離心5 min，取上清液，每孔上樣10 μg蛋白。進(jìn)行10%的分離膠SDS-PAGE，設(shè)置電泳儀恒流30 mA，時(shí)間30 min，電泳完成后，振蕩染色30 min，脫色至背景透明，進(jìn)行凝膠成像儀拍照。

1.3.6 乳清蛋白液相色譜-質(zhì)譜分析的前處理

將脫色好的膠先用500 mL乙腈脫水，風(fēng)干乙腈，加入2 倍體積10 mmol/L二硫蘇糖醇溶液，56 ℃水浴1 h，冷卻吸干，加入55 mmol/L碘乙酰胺避光45 min，清洗脫水，加入胰蛋白酶液，4 ℃靜置30 min，再37 ℃孵育過(guò)夜。加入5 倍體積50%乙腈溶液，5 000×g離心1 min，將上清液移至離心管中，重復(fù)2 次，真空冷凍干燥。抽干的肽段樣品用2%乙腈-0.1%甲酸溶液復(fù)溶，4 ℃、25 000×g離心20 min后，取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.7 儀器測(cè)定條件

液相色譜分離：通過(guò)L C-2 0 A 高效液相色譜儀進(jìn)行分離。樣品首先進(jìn)入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C18柱（15 cm×75 μm，3.6 μm）串聯(lián)，以300 nL/min流速通過(guò)如下有效梯度進(jìn)行分離：流動(dòng)相A（2%乙腈-0.1%甲酸溶液）、流動(dòng)相B（98%乙腈-0.1%甲酸溶液），0～8 min，95% A、5% B；8～43 min，92%～65% A、8%～35% B；43～48 min，6 5%～4 0% A、3 5%～6 0% B；4 8 ～5 0 m i n，40%～20% A、60%～80% B；50～55 min，20% A、80% B；55～65 min，95% A、5% B。納升液相分離末端直接連接質(zhì)譜儀[22-23]。

質(zhì)譜檢測(cè)：經(jīng)過(guò)液相分離的肽段通過(guò)nano電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）源離子化后進(jìn)入到串聯(lián)質(zhì)譜儀LTQ Orbitrap Velos進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴(lài)性采集模式檢測(cè)。主要參數(shù)設(shè)置：nano離子源電壓設(shè)置為1.8 kV。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z350～1 500，分辨率設(shè)置為30 000；二級(jí)質(zhì)譜起始m/z固定為100，分辨率設(shè)置為7 500。進(jìn)行二級(jí)碎裂的母離子篩選條件為：電荷2＋、3＋和4＋以上，峰強(qiáng)度超過(guò)1 000并且排在前12的母離子。高能碰撞解離碰撞能量設(shè)置為35，碎片離子在Orbitrap中進(jìn)行檢測(cè)。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)定為15 s。自動(dòng)增益控制設(shè)置為：一級(jí)1×106，二級(jí)5×104[24]。

1.3.8 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

使用Homo sapiens基因組作為參考，Mascot v2.3.02進(jìn)行搜庫(kù)鑒定，參數(shù)見(jiàn)表1。使用DAVID軟件進(jìn)行Gene Ontology（GO）功能注釋分析、Pathway途徑分析和Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）分析[25-26]。

表1 Mascot搜索參數(shù)Table 1 Mascot search parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

如圖1所示，抗體血清經(jīng)過(guò)Protein A/G agarose純化后，血清中除特異性免疫球蛋白（主要是IgG）以外的多種無(wú)關(guān)蛋白被去除，在25 kDa和50 kDa出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的IgG輕鏈和重鏈，純化效果較好。經(jīng)過(guò)免疫親和柱處理后的樣品在對(duì)應(yīng)的蛋白條帶有所減弱，說(shuō)明免疫親和柱能在一定程度上去除高豐度蛋白，洗脫部分也有對(duì)應(yīng)的蛋白條帶。ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理樣本的SDSPAGE如圖1所示，經(jīng)過(guò)ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理后，35～70 kDa之間有多條新的條帶顯現(xiàn)出來(lái)，同時(shí)在10、25、170 kDa相對(duì)應(yīng)的條帶變淺，上述結(jié)果表明ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒不僅能富集一些低豐度蛋白，同時(shí)能在一定程度上去除高豐度蛋白，試劑盒處理效果較好。

圖1 不同處理后的母乳乳清蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE profiles of breast milk whey proteins with different treatments

2.2 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

將母乳樣品分別經(jīng)過(guò)免疫親和層析和低豐度蛋白富集試劑盒前處理，除去部分高豐度蛋白，最后經(jīng)過(guò)LTQ Orbitrp Velos質(zhì)譜儀檢測(cè)，如圖2所示，免疫親和層析法鑒定49 種蛋白質(zhì)，ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒鑒定出172 種蛋白質(zhì)，2 種方法總共鑒定186 種蛋白質(zhì)，其中有49 種蛋白質(zhì)在母乳中鮮有報(bào)道。

圖2 2 種方法乳清蛋白的Venn圖Fig. 2 Venn diagram showing shared and unique whey protein components identified by the two methods

2.2.1 母乳乳清蛋白的GO注釋分析

對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的研究有助于提高對(duì)乳蛋白質(zhì)的利用和認(rèn)識(shí)[27]。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)母乳中的乳清蛋白質(zhì)，將鑒定的186 種蛋白質(zhì)進(jìn)行GO注釋分析，分別對(duì)其細(xì)胞成分、生物途徑以及分子功能3 個(gè)方面的信息進(jìn)行歸類(lèi)[28]。 如圖3所示，在母乳的乳清蛋白中，13.04%集中在細(xì)胞部分、11.96%在細(xì)胞外區(qū)域、13.22%在細(xì)胞器、8.24%在膜部分；蛋白參與了很多生物途徑，其中有8.5%的蛋白參與生物調(diào)節(jié)、9.04%的蛋白參與代謝過(guò)程，10.95%的蛋白參與細(xì)胞過(guò)程，7.12%的蛋白參與本土化過(guò)程，其余蛋白分別參與了信號(hào)、刺激性反應(yīng)、生物黏附等；母乳乳清中這些蛋白的分子功能主要是結(jié)合活性和催化活性，分別占蛋白的43.82%和27.21%，還有分子功能調(diào)節(jié)、分子傳感器活性等多個(gè)功能。

圖3 母乳乳清蛋白的GO注釋圖Fig. 3 GO functional annotation analysis of breast milk whey proteins

2.2.2 母乳乳清蛋白的Pathway分析

為更進(jìn)一步了解母乳乳清蛋白的代謝路徑，采用DAVID在線(xiàn)分析平臺(tái)對(duì)母乳乳清蛋白進(jìn)行Pathway分析。如表2所示，有181 個(gè)蛋白被識(shí)別，其中有12.71%的蛋白參與代謝途徑，有12.15%的蛋白參與PI3K-Akt信號(hào)通路，有12.15%的蛋白參與吞噬代謝途徑，有8.84%的蛋白參與磷脂酶D信號(hào)通路等，其余代謝路徑包括：癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病等，共有201 個(gè)代謝路徑。

表2 母乳乳清蛋白參與最多的13 個(gè)通路Table 2 Top 13 pathways in which breast milk whey proteins most participate

Pathway分析結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，已經(jīng)注釋功能的蛋白質(zhì)可能參與嬰幼兒某種疾病發(fā)生的多種代謝途徑。

2.2.3 母乳乳清蛋白的COG分析

為更加清楚地了解母乳乳清蛋白質(zhì)的功能，將鑒定到的186 種蛋白質(zhì)和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)可能的功能并對(duì)其做功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。如圖4所示，有19 種蛋白質(zhì)屬于碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝類(lèi)蛋白，有13 種蛋白質(zhì)屬于僅通用功能預(yù)測(cè)，有5 種蛋白質(zhì)屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制類(lèi)蛋白，有4 種蛋白質(zhì)屬于防御機(jī)制類(lèi)蛋白等，其余功能分類(lèi)有：能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等。上述結(jié)果表明，在1 月的母乳中，相關(guān)蛋白主要在碳水化合物的運(yùn)輸和新陳代謝、功能預(yù)測(cè)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起調(diào)控作用。

圖4 母乳乳清蛋白的COG分類(lèi)Fig. 4 COG classification of breast milk whey proteins

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以1 月左右的成熟乳為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)免疫親和層析和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種前處理方法除去部分高豐度蛋白，采用LTQ Orbitrp Velos質(zhì)譜儀檢測(cè)，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。

免疫親和層析處理和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理都有去除部分高豐度蛋白效果，但是試劑盒的效果較好，這可能與制備的抗體有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)是由分離脂肪的母乳作為抗原，然后制備得到多克隆抗體，通過(guò)免疫得到的抗體在制備免疫親和柱之后能洗脫對(duì)應(yīng)的蛋白，說(shuō)明母乳中的酪蛋白、乳鐵蛋白、分泌性IgA以及α-乳白蛋白具有免疫原性，使動(dòng)物產(chǎn)生了抗體，但是抗體產(chǎn)生與免疫原和免疫劑量有關(guān)，微量的低豐度蛋白依然存在產(chǎn)生相應(yīng)抗體的可能，這些抗體的存在會(huì)導(dǎo)致其他蛋白的損失。根據(jù)已有的文獻(xiàn)，Holland等[18]利用半胱氨酸標(biāo)簽法移除了αs1-酪蛋白和β-酪蛋白；楊梅[29]利用等電點(diǎn)的方法去除酪蛋白。本實(shí)驗(yàn)的2 種方法除了去除酪蛋白以外，可能還去除了其他高豐度蛋白，對(duì)鑒定低豐度蛋白可能具有更大意義。

通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)，免疫親和層析法處理后鑒定出49 種蛋白質(zhì)，ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒處理后鑒定出172 種蛋白質(zhì)，2 種方法共鑒定出186 種蛋白質(zhì)。Panchaud等[30]采用分子過(guò)濾法和陰離子交換色譜柱富集了人乳中一些低豐度表達(dá)蛋白質(zhì)，隨后利用SCX/RP進(jìn)行分級(jí)，最終在乳清中定性了43 種蛋白質(zhì)；Liao Yalin等[3]利用蛋白富集試劑盒處理母乳，然后基于1D-LC的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離得到115 種蛋白質(zhì)；Molinari等[31]利用蛋白富集試劑盒處理母乳，然后利用SDS-PAGE、熒光差異雙向電泳、一維基質(zhì)輔助激光解吸電離、二維基質(zhì)輔助激光解吸電離、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)鑒定出415 種蛋白質(zhì)。由于本實(shí)驗(yàn)主要是比較2 種前處理方法除去高豐度蛋白、富集低豐度蛋白的效果，并通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索母乳中的重要活性蛋白，而不是單純?yōu)榱死猛凰貥?biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量等技術(shù)去鑒定到更多的蛋白數(shù)，所以鑒定到的蛋白數(shù)有限。另外，Shen Yunfeng等[32]發(fā)現(xiàn)免疫親和層析技術(shù)在血清蛋白鑒定中會(huì)丟失一些低豐度的蛋白，這可能是這些蛋白與對(duì)應(yīng)的基質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合；Molinari等[31]發(fā)現(xiàn)用ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒母乳樣品之后，一些中等豐度的蛋白質(zhì)可能對(duì)六肽配體文庫(kù)具有非常低的結(jié)合親和力，并且不保留在ProteoMiner珠子上，實(shí)際上，蛋白質(zhì)對(duì)ProteoMiner肽文庫(kù)的不同結(jié)合親和力已經(jīng)被描述為該技術(shù)的主要限制之一，估計(jì)任何給定混合物中5%～15%的蛋白質(zhì)可能完全沒(méi)有結(jié)合[33]。在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，任何一種方法不能完全發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物內(nèi)的所有蛋白，只要該方法有促進(jìn)蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)并能與之前的方法相互補(bǔ)充，就有一定的研究意義。

參考已報(bào)道的文獻(xiàn)[3,19,31]，可能有49 種蛋白質(zhì)未在母乳中檢測(cè)出。其中免疫球蛋白占18%，這表明人乳在保護(hù)嬰兒免受感染中起著至關(guān)重要的作用，盡管有大量文獻(xiàn)描述了母乳喂養(yǎng)對(duì)嬰兒的保護(hù)作用，但其機(jī)制還未闡明[34]。有14%的蛋白質(zhì)具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的作用，如有絲分裂檢查點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對(duì)于紡錘體裝配檢查點(diǎn)信號(hào)傳遞和正確的染色體對(duì)齊至關(guān)重要[35]；Ras GTPase激活樣蛋白，在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)和組裝中起關(guān)鍵作用，可能促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)[36]。還有14%的蛋白質(zhì)目前鮮有報(bào)道。這也說(shuō)明了本研究采用的免疫親和技術(shù)和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒2 種前處理方法均具有一定分離出新蛋白的優(yōu)勢(shì)。

人乳中的某些蛋白質(zhì)可用作炎癥和疾病的標(biāo)志物。一些研究報(bào)道了乳腺炎期間免疫蛋白水平的變化，在乳腺炎發(fā)作期間，乳鐵蛋白、sIgA、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑和血清白蛋白都被發(fā)現(xiàn)在人乳中存在較高水 平[37-38]。關(guān)于牛奶的研究也發(fā)現(xiàn)了許多免疫蛋白[39]，在本研究鑒定的蛋白質(zhì)中，有15 種與腸道免疫網(wǎng)絡(luò)途徑相關(guān)，有22 種與吞噬途徑相關(guān)，有20 種與結(jié)核途徑相關(guān)等，這些都可能具有作為某些炎癥和疾病的標(biāo)志物的潛力。

綜上所述，免疫親和技術(shù)和ProteoMiner低豐度蛋白富集試劑盒可以增加蛋白質(zhì)被檢測(cè)到的幾率，通過(guò)對(duì)這些蛋白質(zhì)的研究，揭示母乳中有很多有生物活性的蛋白值得進(jìn)一步探索，母乳喂養(yǎng)有不可替代的優(yōu)勢(shì)，并對(duì)配方奶粉的改進(jìn)有重要意義。