臥龍自然保護(hù)區(qū)內(nèi)一例病死野豬的病原檢測(cè)

施小剛，鐘銳，黃迪，周瀟瀟，李敏，彭廣能，張靜，何廷美*

（1.四川臥龍國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，四川 汶川 623000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130；3.四川省成都市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；4.四川省汶川縣臥龍?zhí)貏e行政區(qū)，四川 汶川 623000）

豬瘟、非洲豬瘟、藍(lán)耳病、口蹄疫、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）感染、豬丹毒桿菌病、豬巴氏桿菌病、豬鏈球菌病是目前危害家豬比較嚴(yán)重的8 大疾病，這些疾病同樣對(duì)野豬種群存在威脅。2020年4 月2 日，臥龍自然保護(hù)區(qū)巡護(hù)工作人員于臥龍耿達(dá)鎮(zhèn)崔家磨子溝處發(fā)現(xiàn)一只野豬側(cè)躺于溝谷旁，呼吸微弱，未見(jiàn)明顯外傷，驅(qū)趕不能站立行走，后經(jīng)搶救無(wú)效死亡。遂對(duì)病死野豬進(jìn)行以上8種豬病病原檢測(cè)，以探明病因。

1 材料與方法

1.1 臨床和剖解癥狀 野豬體況較差，毛發(fā)根部有出血點(diǎn)，天然孔未見(jiàn)出血；體表有多量蜱蟲(chóng)寄生，四肢、頭面部、肩胛部有大面積脫毛及皮屑。剖解可見(jiàn)腹腔中脾臟體積偏小，胃部有出血點(diǎn)，小腸輕微粘連，盲腸中有大量泥沙碎石沉積，體積膨大，未見(jiàn)腹水；胸腔臟器未見(jiàn)明顯異常。

1.2 病料 采集病死野豬的脾臟及血液樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 病原檢測(cè)

1.3.1 樣品處理 取無(wú)菌的2 mL Lysing Matrix組織研磨管，加入1 mL PBS 液，再加入適量脾臟組織樣品，置于FastPrep-24?5G 研磨儀中研磨，8 000 r/min 離心1 min，取上清液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。脾臟研磨上清液待檢樣品編號(hào)01、02，血液上清待檢樣品編號(hào)03，相應(yīng)陰性對(duì)照編號(hào)04，陽(yáng)性對(duì)照編號(hào)05。

1.3.2 DNA/RNA 的抽提 參照北京世紀(jì)元亨生物科技有限公司的磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，配合KingFisher DUO自動(dòng)化提取儀器，執(zhí)行Tian_KingFisher_Duo.bdz 程序進(jìn)行DNA抽提。程序執(zhí)行完畢，取出DNA，用封口膜封好并保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 核酸擴(kuò)增體系及程序

1.3.3 擴(kuò)增反應(yīng) 參照不同通用型單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，對(duì)豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、口蹄疫病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬丹毒桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌核酸進(jìn)行qPCR或者qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和程序見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

核酸結(jié)果顯示PCV2呈陽(yáng)性（見(jiàn)表2），豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、口蹄疫病毒、豬丹毒桿菌、豬巴氏桿菌、豬鏈球菌的核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性。最終診斷該野豬感染了PCV2。

表2 豬圓環(huán)病毒Ⅱ型熒光定量PCR結(jié)果判定

3 分析與討論

在豬身上已經(jīng)有四種不同的圓環(huán)病毒亞型被鑒定出來(lái)，而PCV2 被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)上具有挑戰(zhàn)性的重要病原體［1］。PCV2 感染可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡、干擾素生成受阻，使機(jī)體免疫反應(yīng)降低，嚴(yán)重的會(huì)引起免疫抑制和多系統(tǒng)病變［2］。PCV2病毒具有高進(jìn)化率的特點(diǎn)，可能以突變的形式逃避免疫應(yīng)答，使得免疫失效，所以對(duì)PCV2 的預(yù)防和治療難度較大［3-4］。本例病死野豬檢測(cè)出PCV2 呈陽(yáng)性,推測(cè)可能是種群攜帶所致，溯源及流行情況需要更多的樣本來(lái)探究。野生動(dòng)物由于環(huán)境壓力、食物限制以及天敵威脅等因素存在自然淘汰的現(xiàn)象，更應(yīng)當(dāng)注意并監(jiān)測(cè)病毒攜帶情況，否則容易引起致病種群數(shù)量的驟減。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，野生動(dòng)物棲息地與人類生活區(qū)域的重合范圍越來(lái)越廣，野生動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物之間傳播疫病的風(fēng)險(xiǎn)也隨之提高。有報(bào)道［5］指出野豬可能是PCV2的長(zhǎng)期寄主，并且能將PCV2傳播到相對(duì)較遠(yuǎn)的地區(qū)，其種群攜帶率可能超過(guò)50%。另有報(bào)道［6］顯示圓環(huán)病毒可以在家豬和野豬之間傳遞，這種傳遞對(duì)野生種群存在威脅，但仍需要更多的數(shù)據(jù)來(lái)支持并發(fā)現(xiàn)其傳播途徑，評(píng)估其對(duì)野生動(dòng)物健康和生態(tài)的實(shí)際影響。