三顆針提取物含量測定及其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌作用的研究

格桑卓嘎，四朗玉珍，拉巴次旦，吳金措姆，班旦

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

三顆針為傳統(tǒng)的中藥、民間藥，用藥歷史悠久、療效廣泛，常用來替代黃柏，主治濕熱瀉痢、黃疸、濕疹、癰腫瘡毒等，《中國藥典》規(guī)定其來源為小檗科小檗同屬多植物的干燥根［1］。全球有500 多種，我國有250 多種，主要分布在云南、西藏、四川三省地區(qū)，其中四川西部、阿壩州、涼山州、川南一帶的三顆針產(chǎn)量豐富且較集中［2］。本屬幾乎都含有極強(qiáng)生物活性的異喹啉類生物堿，其含量與植物的產(chǎn)地、種類、部位等有很大關(guān)系，相關(guān)研究多通過高效液相色譜法（HPLC）以生物堿類化合物為指標(biāo)作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［3］。

金黃色葡萄球菌是一種常見的人獸共患病原菌，可引起人和動物多種感染性死亡，包括敗血癥、心內(nèi)膜炎和膿毒癥等。抗生素的使用及濫用催生并富集了耐藥性菌株，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）感染已成為最難解決的感染性疾患，關(guān)鍵是其對許多抗生素有多重交叉耐藥［4］。α-溶血素（Hla）是一種重要的外分泌蛋白，大量研究表明Hla 是金葡菌致病過程中最重要的毒力因子，尤其是金葡菌性肺炎、乳房炎和角膜炎［5］。

產(chǎn)地是影響中藥材質(zhì)量的主要因素之一［6］，本研究通過HPLC 法測定了川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥铩⒋继崛∥镏械乃幐鶋A、巴馬汀、小檗堿含量并進(jìn)行比較，分析三顆針?biāo)幉脑诓煌a(chǎn)地的含量變化規(guī)律，為開發(fā)利用三顆針植物資源提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 菌種 金黃色葡萄球菌USA300。

1.2 藥材 川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針粉末。

1.3 試劑 鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對照品購自上海某生物科技中心；磷酸、三乙胺購自成都某耗材試劑公司；甲醇（色譜純），乙腈（色譜純），磷酸（色譜純），三乙胺（色譜純），TSB、TSA培養(yǎng)基購自青島某生物技術(shù)公司。

1.4 儀器 高效液相色譜儀，電子分析天平，pH計(jì)，超凈工作臺，手提式高壓滅菌器，電熱恒溫培養(yǎng)箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SZ-9327自動三重純水蒸餾器等。

2 方法

2.1 三顆針?biāo)⒋继崛∥锏闹苽?取川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針粉末40 g，以料液比1 g∶10 mL 浸泡30 min后加熱提取2 次，每次1 h。取粉碎的川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針粉末40 g，用甲醇以料液比1 g∶10 mL靜置3d，提取2次。分別合并兩次提取液，以4000 r/min離心5 min，取上清液，旋蒸濃縮至水提液體積的1/20左右，冷凍干燥后備用。

2.2 HPLC測定三顆針提取物的含量

2.2.1 色譜條件 使用BDS C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測流動相：0.05 mol/L 磷酸/三乙胺∶乙腈（76∶24，pH＝2.4），檢測波長：346 nm，每次進(jìn)樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對照品，配制成濃度為80、40、20、10、4 μg/mL（鹽酸小檗堿）以及40、20、10、4、2 μg/mL（鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀）的對照品溶液。

2.2.3 線性范圍測定 精密吸取各濃度鹽酸小檗堿對照品溶液、鹽酸藥根堿對照品溶液、鹽酸巴馬汀對照品溶液，分別以10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取4 μg/mL鹽酸小檗堿、2 μg/mL 鹽酸藥根堿、2 μg/mL 鹽酸巴馬汀進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測定，同時記錄平均峰面積、RSD值。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 分析測定，同時記錄鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀的平均峰面積、RSD值。

2.2.6 樣品含量測定 分別取川產(chǎn)、藏產(chǎn)水提和醇提粉末各0.04 mg，用甲醇定容于5 mL 容量瓶中，搖勻，再取醇提樣品2.5 mL于5 mL容量瓶中，作為樣品溶液。按上述色譜條件測定峰面積，重復(fù)3次，根據(jù)平均峰面積計(jì)算鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀的含量。

2.3 三顆針提取物亞抑菌濃度對金黃色葡萄球菌的影響

2.3.1 藥物貯存液的制備 用DMSO（二甲基亞砜）將川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)嵛锖痛继嵛锓謩e配成500 mg/mL 生藥濃度，分裝于5 mL滅菌離心管，用封口膜封口，置4℃儲藏備用。

2.3.2 藥物最小抑菌濃度的測定 采用微量肉湯稀釋法測定三顆針對金葡菌USA300的最低抑菌濃度（MIC），其中第1孔至第8孔三顆針的質(zhì)量濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 mg/mL；第9 孔為陽性對照，培養(yǎng)基中只加菌液；第10 孔為溶劑對照，培養(yǎng)基中只加二甲基亞砜；第11 孔為空白對照。37 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，肉眼觀察以無菌生長、澄清透明的質(zhì)量濃度為MIC，重復(fù)測三次。

2.3.3 亞抑菌濃度下菌株生長曲線的繪制 金黃色葡萄球菌于37 ℃200 r/min 搖床過夜培養(yǎng)16 h 至OD600為0.1，5 000 r/min 離心10 min，用生理鹽水重懸。將菌懸液與TSB 培養(yǎng)基、藥液混合，稀釋成OD600約0.1 的菌懸液，使提取物的終濃度分別為其亞抑菌濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），以TSB 培養(yǎng)基、菌液為對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5、6、8、12、24 h 測OD600值，記錄并整理數(shù)據(jù)，繪制生長曲線。

2.3.4 結(jié)晶紫染色法檢測生物被膜形成 金黃色葡萄球菌于37 ℃200 r/min 搖床培養(yǎng)16 h，按1∶100 的比例稀釋菌懸液。將菌懸液與TSB 培養(yǎng)基、藥液混合，加入96孔板（200 μL/孔），使提取物的終濃度分別為其亞抑菌濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC），以TSB 培養(yǎng)基、菌液為對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24、48 h，取板，重復(fù)三次取平均值。

采用改良后的96孔微孔板BF定量檢測方法檢測：用滅菌后的PBS 洗滌3次，除去雜質(zhì)和浮游菌；取200 μL 甲醇固定15 min 后舍棄甲醇溶液，晾干培養(yǎng)板，每孔加200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色液染色15 min，用蒸餾水洗去多余的染色液，晾干；每孔加200 μL 33%冰醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，利用酶標(biāo)儀測定其OD595nm值，重復(fù)三次取平均值。

2.3.5 金葡菌溶血能力的測定 將金黃色葡萄球菌接種于TSB 培養(yǎng)基，于37 ℃200 r/min 搖床培養(yǎng)16 h，按100 倍稀釋至新鮮培養(yǎng)基，分別加入不同濃度（1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）三顆針提取物于4 mL 離心管中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)（37 ℃，200 r/min）16 h，然后以10 000 r/min 離心5 min，收集培養(yǎng)物上清。將400 μL 培養(yǎng)物上清和400 μL 5%脫纖維兔血反應(yīng)體系混勻，然后置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育20 min，10 000 r/min 離心5 min，收集反應(yīng)體系上清并檢測樣品的吸光度值（OD543nm），重復(fù)三次取平均值。

以菌液為對照組，設(shè)定為100%溶血；以TSB為空白組，設(shè)定為0%溶血。每組樣品的溶血比例與對照組作對比。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；組間比較采用方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異顯著；用Prism 8.0 對圖像進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為Y＝30 975X+15 072，Y＝32 395X+30 359，Y＝32 87X+1 187.6。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在4～90μg/mL（r＝0.9995），鹽酸藥根堿在2～50 μg/mL（r＝0.999 7），鹽酸巴馬汀在2～50 μg/mL（r＝0.999 6）范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn) 鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的精密度見表1。由表1 可見，三者的RSD均小于2%，說明儀器的精密性良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果見表2、表3。川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥铩⒋继崛∥飿悠吩?2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4 三顆針提取物樣品含量的測定 結(jié)果見表4、表5。三顆針?biāo)崛∥镏兴幐鶋A、巴馬汀、小檗堿的含量分別為0.476 1、0.436 9、4.792 mg/g（川產(chǎn)）和0.403 2、2.641 2、4.341 3 mg/g（藏產(chǎn)）；三顆針醇提取物中藥根堿、巴馬汀、小檗堿的含量分別為0.723、0.631 8、7.945 3 mg/g（川產(chǎn)）和0.768 8、5.115 7、8.067 6 mg/g（藏產(chǎn)）。

3.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定 川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥飳瘘S色葡萄球菌的MIC 均為25 mg/mL，川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針醇提取物對金黃色葡萄球菌的MIC均為12.5 mg/mL（見表6）。

3.6 三顆針在亞抑菌濃度下對金黃色葡萄球菌生長的影響 三顆針的抑菌作用具有濃度依賴性，1/2MIC時仍能在很長時間內(nèi)抑制金黃色葡萄球菌的生長，1/4MIC仍有較強(qiáng)的抑菌作用，但是比1/2MIC 的抑菌能力弱，1/8MIC濃度時的抑菌作用不明顯。

表2 三顆針?biāo)崛∥锓€(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表3 三顆針醇提取物穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4 三顆針?biāo)崛∥锖繙y定結(jié)果 mg/g

表5 三顆針醇提取物含量測定結(jié)果 mg/g

表6 三顆針提取物最小抑菌濃度測定結(jié)果 mg/mL

3.7 三顆針對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響 由圖1、圖2 可知，亞抑菌濃度下的三顆針提取物均對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300生物被膜的形成有影響，在24 h 時差異極顯著，在48 h 時1/4MIC 和1/8MIC 的 藥效開始降低。

3.8 三顆針對金黃色葡萄球菌α-溶血素表達(dá)的影響 隨著濃度不斷增加，顏色逐漸由紅色變成無色，川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥铩⒋继崛∥镌?/2MIC時顏色達(dá)到最淺，接近空白組的顏色（P＜0.01）。川產(chǎn)、藏產(chǎn)醇提取物在不同濃度下可以使金葡菌的溶血能力下降，對α-溶血素有一定的抑制作用。醇提取物對USA300的抑制作用比水提取物更強(qiáng)，且川產(chǎn)三顆針醇提取物的抑制效果最好（圖3）。

4 討論

對三顆針化學(xué)成分研究較多的是小檗堿、藥根堿、巴馬汀、小檗胺等季銨類生物堿［7］，因此多通過HPLC 法同時測定幾種生物堿含量，以綜合評價三顆針的質(zhì)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明三顆針醇提取物中的3 種生物堿（藥根堿、巴馬汀和小檗堿）含量均高于水提取物，MIC試驗(yàn)結(jié)果表明醇提取物比水提取物具有更明顯的抑菌效果，說明甲醇更容易提取三顆針中的有效抑菌物質(zhì)。川產(chǎn)、藏產(chǎn)三顆針提取物中，含量最高的是小檗堿；藏產(chǎn)三顆針?biāo)崛∥铩⒋继崛∥镏械陌婉R汀含量都比川產(chǎn)的高。

圖1 三顆針提取物對金黃色葡萄球菌生物膜24 h的消除作用

圖2 三顆針提取物對金黃色葡萄球菌生物膜48 h的消除作用

圖3 三顆針提取物與USA300培養(yǎng)物上清對兔紅細(xì)胞的溶血作用

本試驗(yàn)表明三顆針醇提取物對USA300 的MIC（25 mg/mL）比水提取物（12.5 mg/mL）更高，抑菌效果更顯著。抗菌活性試驗(yàn)表明，在三顆針有效活性濃度范圍內(nèi)，1/8MIC對金黃色葡萄球菌的生長幾乎沒什么影響，1/4MIC、1/2MIC 對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。生物被膜的抑制和清除試驗(yàn)表明，三顆針對USA300 24 h 和48 h的生物被膜均具有抑制和清除作用，且高劑量的清除作用明顯，低劑量時USA300 呈現(xiàn)緩慢增長的趨勢。

金黃色葡萄球菌感染后會產(chǎn)生多種毒力因子，特別是α-溶血素能誘導(dǎo)金葡菌產(chǎn)生細(xì)胞自噬反應(yīng)，引起強(qiáng)烈的組織損傷，破壞宿主的免疫系統(tǒng)。本試驗(yàn)表明，隨著三顆針提取物濃度的增加，金葡菌溶血能力呈逐漸下降的趨勢，亞抑菌濃度下也能抑制致病菌分泌α-溶血素。

5 結(jié)論

三顆針提取物對MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株USA300 有顯著的抑菌作用，且對USA300 生物被膜的形成和α-溶血素有良好的抑制作用，但作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。