不同劑量骨髓間充質干細胞對阿霉素腎病大鼠腎纖維化形成的影響

楊 揚，王家平，白彝華，李天祎，李嘉琦，張 婭

腎間質纖維化是慢性腎病進展至終末期腎病必經的共同病理途徑［1-2］，也是加速疾病惡化的關鍵因素，使得慢性腎病患者腎臟結構發生不可逆病理改變，導致腎衰竭。目前許多研究表明，腎間質纖維化發生發展可能與缺氧、炎性反應、腎臟固有細胞損傷及促纖維化形成因子參與相關［3-7］，但具體機制尚未明確；針對腎間質纖維化的治療手段有限，主要有抗炎、 抗凋亡、 調節細胞外基質（extracellular matrix，ECM）形成與降解等［8-10］，效果不理想。隨著再生醫學興起，干細胞療法展現出良好應用前景。有研究表明，脂肪干細胞在動物腎臟疾病模型中可延緩腎間質纖維化［11-12］。本中心前期研究發現骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）對受損腎組織發揮積極的修復作用，能顯著改善腎功能［13］。本實驗旨在研究 BMSC 對阿霉素慢性腎病大鼠腎纖維化形成的影響，并探索其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

47 只雄性清潔級 Sprague-Dawley（SD）大鼠由昆明醫科大學實驗動物中心提供（許可證號：SCXK滇 K2015-0002）。2 只 4 周齡大鼠，體質量 100～120 g，用于 BMSC 體外分離培養。45 只 7 周齡大鼠，體質量（261±7.9） g，其中 36 只用于阿霉素造模，9 只作為正常對照。主要試劑和儀器：低糖培養基、胎牛血清（FBS）（美國 Gibco 公司），阿霉素（美國Sigma 公司），BMSC 成骨成脂誘導培養基（賽業蘇州生物科技公司），抗轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、 纖維連接蛋白（fibronectin，FN）抗體，蘇木精-伊紅（HE）、Masson 和過碘酸六胺銀（PASM）染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技公司），Eclipse Ci 型光學顯微鏡（日本Nikon 公司）。

1.2 制備BMSC

利用BMSC 具有高度黏附于塑料細胞培養瓶特性，行體外分離培養。根據宮宇等［14］報道方法，無菌條件下取大鼠雙側股骨、脛骨，磷酸緩沖液（PBS）沖洗骨髓腔，收集沖洗液，用100 μm 細胞篩過濾去除碎骨片等雜質，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用含10%FBS、1%青鏈霉素雙抗和0.1%非必需氨基酸的低糖培養基重懸細胞，接種至細胞培養瓶，置于細胞孵箱中培養；待細胞融合至90%～100%時予以消化傳代，取P5 代細胞并用流式細胞儀行表面抗原鑒定，行成骨成脂誘導分化。

1.3 實驗動物造模與分組

36 只大鼠通過尾靜脈注射阿霉素方式造模，首次劑量3 mg/kg，間歇2 周后，相同劑量再次注射。血肌醉、血尿素氮值和24 h 尿蛋白水平顯著升高后處死大鼠，取腎制作切片并行HE 染色，光鏡下觀察到腎臟結構符合慢性腎病改變提示造模成功［15］。本實驗中第2 次注射阿霉素后7 周左右成模。將造模成功大鼠隨機分為 M 組（模型組）、A 組、B 組、C 組，每組各9 只；另取9 只健康大鼠作為正常對照組（N組）。N 組大鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液0.5 mL；A 組、B 組、C 組大鼠參照陸發承等［16］介入操作方法，通過腎動脈途徑分別移植BMSC 懸液0.5 mL，劑量分別 1×106個/mL、2×106個/mL、3×106個/mL；M組則經腎動脈輸注等量PBS。術后4 周，處死各組大鼠，取腎組織固定備用。

1.4 主要觀測指標

術后第4 周，觀察各組大鼠一般情況，如毛發、精神狀態、活動度及體重改變等。處死大鼠取腎組織固定 24 h，石蠟包埋，制作 5 μm 石蠟切片。Masson 染色分析各組大鼠腎臟纖維化情況，計算膠原纖維面積百分比，隨機挑選各組腎組織切片，以200 倍視野拍攝，藍染膠原纖維為陽性信號，計算藍染區域占整個面積百分比，評估纖維化程度。PASM染色比較分析各組大鼠腎小球、 腎小管基膜變化，基膜增厚為陽性區域，測量陽性面積占視野內組織面積百分比。免疫組化染色法觀察分析TGF-β1 和FN 在腎組織不同部位分布情況與表達差異。

1.5 統計學分析

數據處理采用SPSS 23.0 統計學軟件。結果以均數±標準差（）表示，組間比較用方差分析，兩兩比較用最小顯著性差異t 驗檢，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

阿霉素造模后大鼠精神狀態差，毛發毛躁，缺乏光澤，活動度下降，反應遲鈍，食欲差，部分大鼠出現輕度腹瀉現象，體重下降。腎動脈移植BMSC后，A、B、C 組大鼠食欲改善，精神狀態好，活動靈敏，體重逐漸增加，C 組大鼠較A、B 組改善明顯，但各組間體重差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 腎動脈移植BMSC 后各組大鼠體重比較 g，

表1 腎動脈移植BMSC 后各組大鼠體重比較 g，

a 與 N 組比較，P＜0.05；b 與 M 組比較，P＜0.05

組別 移植前 移植后2 周 移植后4 周N 組（n=9） 298.33±25.04 301.56±25.67 302.56±23.10 M 組（n=9） 272.78±17.77a 266.11±13.23a 266.33±14.57a A 組（n=9） 278.33±14.02a 279.67±13.02a 283.22±12.22ab B 組（n=9） 276.22±12.20a 280.22±11.58a 283.33±11.57ab C 組（n=9） 277.33±11.74a 280.11±11.00a 286.11±8.40ab

2.2 大鼠腎組織Masson 染色與膠原纖維面積測量

N 組大鼠腎組織正常，腎小球囊周圍和腎間質均未見著色。M 組大鼠腎小球囊擴張，間質增寬，部分區域失去正常腎臟結構，被纖維組織代替，呈大面積藍染表現，大量腎小球囊及腎間質著色；A、B、C組大鼠腎間質也存在不同程度增寬，但較M 組窄，腎小球囊和腎間質呈不同程度著色改變，但較M 組淺，著色程度為 M 組＞A、B、C 組＞N 組，見圖 1。半定量結果經統計學分析顯示，腎組織膠原纖維面積在 M 組較 N 組顯著增大（P＜0.01），A、B、C 組較 M 組縮小（P＜0.05），且隨著移植細胞增多呈減少趨勢，其中 A 組膠原纖維面積大于 B、C 組（P＜0.05），C組纖維化改善情況較B 組好，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

圖1 各組大鼠腎組織膠原纖維沉積比較（Masson 染色，20×）

表2 腎組織膠原纖維、腎小球腎小管基膜增厚面積測量比較 %，

表2 腎組織膠原纖維、腎小球腎小管基膜增厚面積測量比較 %，

a 與 N 組比較，P＜0.01；b 與 M 組比較，P＜0.05；c 與 A 組比較，P＜0.05

組別 膠原纖維面積 基膜增厚面積N 組（n=9） 1.00±0.38 2.31±0.75 M 組（n=9） 24.02±3.05a 16.46±2.98a A 組（n=9） 19.41±2.04ab 14.19±1.84ab B 組（n=9） 15.09±2.10abc 11.94±1.82abc C 組（n=9） 12.49±1.49abc 10.89±1.14abc

2.3 PASM 染色比較各組大鼠腎組織基膜改變

N 組腎小球基底膜、 腎小管基膜未見增厚。M組腎小球基底膜明顯增厚，大量腎小管基膜增厚，PASM 染色見大面積深染區域；A、B、C 組腎組織亦存在不同程度基膜增厚現象，其中以A 組增厚明顯，B、C 組增厚情況有所緩解，腎小管基膜增厚減少，部分腎小球基底膜增厚，見圖2。半定量結果分析顯示，與 M 組相比，A、B、C 組腎小球基底膜、腎小管基膜增厚情況均有所改善（P＜0.05），基膜增厚情況為A 組＞B 組＞C 組，而 B 組與C 組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2。

2.4 腎組織TGF-β1 表達情況

TGF-β1 在N 組腎組織中不表達或弱陽性表達，在M 組腎小球和腎小管間質、管腔中強陽性表達，在A、B、C 組腎小球、腎間質和腎小管管腔內弱陽性表達，且范圍較M 組小，見圖3。

2.5 腎組織FN 表達情況

FN 在N 組不表達或弱陽性表達，在M 組腎小球、腎小管管腔及上皮細胞中強陽性表達，在A、B、C 組腎小球、 腎小管上皮細胞中呈陽性或弱陽性表達，但與M 組比較表達范圍縮小，程度減弱，尤其以C 組改善最為明顯，見圖4。

圖2 各組大鼠腎小球腎小管基膜染色結果比較（PASM 染色，20×）

圖3 各組大鼠腎組織不同部位TGF-β1 表達比較（免疫組化染色，20×）

圖4 各組大鼠腎組織不同部位FN 表達比較（免疫組化染色，20×）

3 討論

腎間質纖維化是ECM 在腎小管和管周毛細血管間過度沉積導致，其特點是腎間質和腎小球均有毛細血管網破壞丟失及纖維狀膠原沉積，因此間質纖維化程度被認為是慢性腎臟疾病病程進展的最佳預測因子［17］。研究表明，病理條件下系膜細胞被激活而過度增殖，系膜細胞可分泌血管基質成分如Ⅳ型、Ⅴ型膠原蛋白、FN，使得ECM 產生過多，導致腎間質纖維化和腎小球硬化，其中FN 為ECM 最主要組成成分，腎小球基底膜增厚則是腎小球硬化直接表現［18］。

本研究采用Masson 染色評估腎臟纖維化程度，免疫組化染色觀察FN 在腎組織不同部位表達，PASM 染色比較腎小球基底膜增厚情況。Masson 染色結果顯示，阿霉素誘導SD 大鼠腎組織發生腎小球和腎間質纖維化，M 組腎組織見大量腎小球和大面積腎間質藍染，著色程度深，而經腎動脈移植不同劑量BMSC 后，被藍染的膠原纖維面積呈現減少趨勢，著色淺，其中A 組膠原纖維面積大于B、C 組（P＜0.05），而 C 組纖維化改善情況較 B 組好，但兩組間差異無統計學意義（P＞0.05），提示腎動脈移植BMSC 能夠延緩或抑制阿霉素慢性腎病大鼠腎組織纖維化發生發展，并隨著移植BMSC 數量增加而加強對腎臟纖維化的保護作用；免疫組化染色結果顯示，M 組腎小球、 腎小管管腔及上皮細胞中呈強陽性，A、B、C 組與M 組相比腎小管管腔中幾乎不表達，僅在部分腎小球和腎小管上皮細胞中呈陽性或弱陽性表達，尤其以C 組改善最為明顯（P＜0.05），提示阿霉素誘導腎纖維化與ECM 過度沉積有關，而腎動脈移植BMSC 能減少腎組織尤其是腎小管中ECM 過度沉積，改善腎間質纖維化；PASM 染色結果顯示，M 組腎小球基底膜明顯增厚，A、B、C 組與M 組相比腎小球基底膜增厚情況均有所改善（P＜0.05），提示腎動脈移植BMSC 能減少腎小球中ECM 過度沉積，緩解腎小球硬化。

關于腎臟纖維化形成機制的研究眾多，目前較為一致的觀點是，TGF-β 及其介導的 Smad 或非Samd 信號通路導致纖維化。TGF-β1 是目前研究最為明確的促纖維化因子，參與導致慢性腎臟病并進展至終末期腎病的動態病理過程，其可能通過以下方式促進腎臟纖維化：一是TGF-β1 直接誘導ECM形成；二是通過抑制基質金屬蛋白酶（MMP）并誘導其拮抗劑基質金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）顯著抑制ECM 降解，刺激ECM 積累；三是誘導腎臟固有細胞（如腎小管上皮細胞）發生上皮-間質細胞轉化（EMT），引起成纖維細胞增生，分泌產生大量ECM；四是直接刺激腎臟系膜細胞增生，導致ECM 過度沉積［19-20］。本實驗通過檢測 TGF-β1 表達變化探索阿霉素誘導腎纖維化的可能機制，結果發現高劑量（3×106個/mL）BMSC 通過腎動脈移植后能明顯改善大鼠一般情況，尤其對體重的恢復較為明顯；與 M 組相比，A、B、C 組 TGF-β1 在腎小球、腎間質及腎小管管腔內呈弱陽性表達，不僅程度較M 組弱，且范圍較M 組小；提示BMSC延緩或抑制腎臟纖維化的作用，可能是通過下調TGF-β1 表達，從而抑制上述幾種可能作用途徑實現的。

綜上所述，在以ECM 過度沉積為特征的腎臟纖維化中，BMSC 對阿霉素誘導的早期腎纖維化形成具有積極的治療作用，其機制可能是通過下調TGF-β1 表達減少ECM 在腎組織不同部位沉積，進而發揮延緩或抑制腎臟纖維化的作用，而高劑量BMSC 效果更為明顯。