復方丹皮酚納米乳中丹皮酚和靈芝多糖的含量測定

蘇酩，袁敏，孫曉彤，隋在云*

(1.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；2.濰坊弘景中醫藥學校，山東 濰坊 261057)

癌癥是目前世界公認的醫療難題，治療難度高，發病率逐年上升。其中，肺癌死亡率居于首位，其惡性程度高，嚴重威脅人類健康與生命[1-2]。隨著對癌癥的深入研究，治療藥物劑型不斷改進，治療效果不斷提高。復方丹皮酚納米乳是本課題組研制的一種新型抗肺癌藥物，其研究開發對于延長患者生命、改善患者的生活質量具有非常重要的臨床意義。

丹皮酚的抗腫瘤作用顯著[3-4]，靈芝多糖也具有明顯的抗腫瘤及免疫調節作用[5-6]，得到國內外學者的廣泛關注。復方丹皮酚納米乳是由脂溶性的丹皮酚與水溶性的靈芝多糖制成的納米乳劑，既解決了丹皮酚水溶性差、藥物含量低、物理性質不穩定的問題，又解決了與靈芝多糖不能混合溶解的難題，能夠提高藥物的穩定性，增強抗癌活性。課題組前期研究發現，該制劑對人肺癌A549細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用[7]。

丹皮酚在藥材、中藥制劑中的含量測定方法有紫外分光光度法、膠束熒光法、差示分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，這些方法各有優缺點。而中藥制劑的藥味較多，成分復雜，多選用高效液相(HPLC)或氣相色譜法進行定量分析，操作簡單，結果理想。丹皮酚是復方丹皮酚納米乳劑的主要有效成分，但其為脂溶性，難溶于靈芝多糖水溶液[6]。本制劑將丹皮酚包封制成納米乳，以提高水溶性差的丹皮酚的溶解度，故丹皮酚的含量及包封率直接影響制劑的質量。

本研究參照相關文獻[8-12]，分別采用HPLC法、硫酸蒽酮比色法對本制劑中的丹皮酚、靈芝多糖含量進行測定，建立了復方丹皮酚納米乳制劑中丹皮酚、靈芝多糖的含量測定方法，并對包封率的測定進行了研究。本方法簡便、快速、準確，為制定復方丹皮酚納米乳劑可行可控的質量標準提供了試驗基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀，Ultimate 3000紫外檢測器，Chromeleon7工作站(美國Thermo公司)；FA2004B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；JP-010潔盟牌超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；TDL-40B型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)等。

1.2 試藥

丹皮酚(中國食品藥品檢定研究院，批號110708-201407)；D(+)-無水葡萄糖對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號S08J6G1)；蒽酮(國藥集團化學試劑有限公司)；葡聚糖凝膠G-50(上海源葉生物科技有限公司)；水(娃哈哈公司)；甲醇、硫酸等所用試劑均為色譜純或分析純。三批復方丹皮酚納米乳(批號20170201、20170202、20170203)由本課題組提供。

2 方法與結果

2.1 丹皮酚的含量測定

2.1.1 色譜條件

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品0.2 mL置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備

取丹皮酚對照品加甲醇配成濃度為22.6 μg/mL的對照品溶液，即得。

2.1.4 色譜柱的篩選

使用色譜柱Lichrospher C18(150 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技公司)、ODS Hypersil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Thermo公司)、ODS-2 Hypersil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm，美國Thermo公司)，參照2.1.2項下方法進行測定。結果前兩者色譜峰峰形不佳，有拖尾現象，最終選擇色譜柱ODS-2 Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Thermo公司)，色譜峰對稱性良好。

2.1.5 專屬性試驗

取缺丹皮酚空白納米乳按2.1.2項下方法制得缺丹皮酚陰性對照溶液。取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按選定色譜條件進行分析，結果發現缺丹皮酚陰性對照的色譜圖中無干擾峰。表明該方法專屬性好，見圖1。

圖1 丹皮酚 HPLC色譜圖

2.1.6 線性關系考察

將對照品溶液分別進樣1、3、5、10、15 μL，按選定色譜條件進行分析。得線性回歸方程為y=77.255x+0.030 5(r=1.000 0)，表明丹皮酚進樣量在0.022 6～0.339 0 μg范圍內線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗

取對照品溶液連續測定6次，峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.175 %。

2.1.8 穩定性試驗

取供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，峰面積的RSD為1.33 %，表明本品24 h內穩定性良好。

2.1.9 重復性試驗

取本品(批號20170201)0.2 mL，平行6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，丹皮酚含量的RSD為0.233%。

2.1.10 加樣回收率試驗

精密量取本品(批號20170201)0.1 mL，平行6份，分別加入丹皮酚對照品0.801 mg，混勻，按2.1.2項下方法制備，結果平均回收率為99.80 %，表明該方法回收率良好，見表1。

表1 回收率試驗結果

2.1.11 樣品含量測定

將對照品溶液與3批供試品溶液按選定色譜條件進行測定，結果表明3批制劑中丹皮酚的含量穩定，差別較小，見表2。

表2 測定結果

2.2 靈芝多糖的含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備

分別取本品10 mL于3個錐形瓶中，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇60、80、100 mL，于4 ℃放置12 h后，加入60 mL與100 mL乙醇的錐形瓶中液體呈渾濁狀態，而加入80 mL乙醇的錐形瓶中液體沉淀明顯，因此確定乙醇加入量為80 mL。確定的制備方法為：取本品10 mL于錐形瓶中，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇80 mL，于4 ℃放置12 h后，離心10 min(4000 r/min)，將沉淀物加水溶解后轉移至50 mL量瓶中，加水至刻度，備用。精密量取1 mL置于50 mL量瓶中，加水定容，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備

取無水葡萄糖對照品加水配成濃度為0.139 5 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 缺靈芝多糖陰性對照溶液的制備

取缺靈芝多糖空白納米乳10 mL于錐形瓶中，按2.2.1項下方法制備，即得。

2.2.4 專屬性試驗

取供試品溶液、對照品溶液及缺靈芝多糖陰性對照溶液，按《中國藥典》[11]中的蒽酮硫酸比色法進行檢測，分別在400～700 nm波長范圍內掃描，結果缺靈芝多糖陰性對照無干擾，最大吸收波長為625 nm。見圖2。

1—為無水葡萄糖；2—為供試品；3—為缺靈芝多糖空白。

2.2.5 標準曲線的制備

按照《中國藥典》[11]方法得回歸方程為y=0.041 02x-0.013 96(r=0.999 6)，線性范圍0～16.74 mg/L。

2.2.6 精密度試驗

取供試品溶液連續測定6次，吸光度的RSD為0.168%。

2.2.7 穩定性試驗

取供試品溶液每間隔10 min測定1次，50 min內的吸光度的RSD為1.09 %。

2.2.8 重復性試驗

取供試品溶液平行測定6份，靈芝多糖含量的RSD為1.78 %。

2.2.9 加樣回收率試驗

取2.2.1項下的備用溶液0.5 mL置于50 mL量瓶中，平行6份，加入無水葡萄糖對照品0.148 mg，加水至刻度，按藥典中檢測法測定結果平均回收率為 98.23%。表明該方法回收率良好，結果見表3。

表3 回收率試驗結果

2.2.11 樣品含量測定

取對照品溶液與3批供試品溶液測定靈芝多糖的含量，結果表明3批制劑中靈芝多糖的含量穩定，差別較小，見表2。

2.3 包封率的測定

2.3.1 納米乳洗脫曲線的制備

稱取葡聚糖凝膠G-50 1.1 g，加水200 mL溶脹24 h，濕法裝柱(內徑1.0 cm，柱長40 cm)，精密吸取本品0.2 mL上樣，洗脫速度為0.5mL/min，收集洗脫液于離心管(1 mL/管)中，共收集80管。將每管洗脫液分別轉移至2 mL量瓶中，加甲醇定容。按2.1.1項下的色譜條件進樣測定，以管數為橫坐標，丹皮酚峰面積為縱坐標繪制洗脫曲線。結果見圖3。

圖3 復方丹皮酚納米乳洗脫曲線

結果顯示，本品通過葡聚糖凝膠柱后，游離丹皮酚與納米乳分離，前20管為復方丹皮酚納米乳流出曲線，從第21管為游離丹皮酚的流出曲線，即納米乳先被洗脫出，游離丹皮酚后被洗脫出。

2.3.2 包封率的測定方法

分別精密吸取3批復方丹皮酚納米乳0.2 mL，按2.3.1項下方法制備，收集洗脫液前20管至50 mL量瓶中，加甲醇定容，按2.1.1項下的色譜條件進樣測定，計算含量，得被包封的丹皮酚濃度c1。精密吸取本品0.2 mL至100 mL量瓶中，加甲醇定容，按2.1.1項下的色譜條件進樣測定，計算含量，得本品中丹皮酚的總濃度c2。包封率計算為：丹皮酚的包封率=(c1/c2)×100%。結果3批制劑中丹皮酚的包封率均大于97%(見表2)，包封率高。

3 結論

本研究采用HPLC 法對復方丹皮酚納米乳制劑的丹皮酚進行含量測定研究，采用硫酸蒽酮比色法測定靈芝多糖的含量，并對該制劑中丹皮酚的包封率進行了評價。結果3批復方丹皮酚納米乳中丹皮酚、靈芝多糖的平均含量分別為7.612、6.127 mg/mL，平均包封率為97.99%，含量穩定均一，包封率高。本研究建立的含量測定方法簡便可行，快速準確，可作為復方丹皮酚納米乳的質量標準，為同類新型乳劑的研究提供參考，為開發治療肺癌的中藥新藥提供科學依據。