基于網絡藥理學研究黃芪-半枝蓮藥對治療肺癌機制

侯玥，李強，王岱杰，崔莉，鄭心, 3*

(1.山東中醫藥大學 中醫學院，山東 濟南 250014；2.齊魯工業大學(山東省科學院)山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3.青島海慈醫療集團，山東 青島 266033)

肺癌(lung cancer)又稱原發性支氣管肺癌(primary bronchial lung cancer)，是發病率最高的癌癥之一，也是近五年死亡率最高的惡性腫瘤之一[1-2]。在我國，肺癌發病率和死亡率均高居首位[3]。手術是肺癌患者首選治療方法，然而80%的患者確診時已失去手術機會，一線治療方案存在不可避免的副作用，而中醫藥可以輔助增強抗腫瘤療效并減輕相關毒副作用，改善患者生存質量，因此對中醫藥抗腫瘤資源的挖掘是大勢所趨[4]。中醫認為癌癥的病機多為正虛兼痰瘀毒互結，治療應遵循扶正解毒、標本兼治的原則[5-6]。基于肺癌臨床用藥數據挖掘發現，黃芪和半枝蓮分別作為補虛藥和解毒藥，擁有高使用頻率[7-9]。研究表明，黃芪組分可以通過免疫、自噬、PI3K/Akt等多種途徑抑制肺癌增殖并誘導其凋亡[10-12]。半枝蓮組分通過EGFR、HIF-1α等多途徑抑制肺癌細胞系增殖[13-14]。現代研究證明了黃芪和半枝蓮抑制肺癌的機制，但是結合中醫癌癥虛實夾雜的發病理論，對兩藥的協同作用以及相關通路和分子機制的研究還未見報道。本研究基于網絡藥理學對黃芪-半枝蓮(AR-SBH)藥對進行了系統分析，預測了該藥對的作用靶點和分子機制，闡明了該藥治療肺癌的理論基礎，為進一步研究提供依據和思路。

1 材料與方法

1.1 黃芪-半枝蓮化學成分收集以及相應靶點預測

應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology and Analysis Platform，TCMSP)[15]收集黃芪-半枝蓮有效成分。根據 Lipinski的5個規則，即分子量<500、-2<脂水分配系數<5、氫鍵供體數(Hdon)<5、氫鍵受體數(Hacc)<10、旋轉鍵數(RBN)<10[16]和ADME(absorption, distribution, metabolism, excretion)特性，設置類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥40%[17]篩選出活性較高的化合物。進一步收集TCMSP 數據庫和比較毒物基本組學數據庫(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)[18]數據庫中收錄的黃芪-半枝蓮化合物靶點并使用Uniprot數據庫統一標準化為基因名(gene name)，剔除無效、重復靶點，用軟件Cytoscape 3.7.1繪制黃芪-半枝蓮藥對的藥物-化合物-靶點圖。

1.2 肺癌相關疾病靶點收集

與原發性支氣管肺癌相關的基因來源于人類基因綜合數據庫(GeneCard)[19]，可以檢索與人類疾病相關的基因。輸入“lung cancer”和“primary bronchial lung cancer”，得到數據庫收錄的肺癌相關靶基因。

1.3 靶點映射和目標靶點 PPI網絡的構建

將化合物靶點和疾病相關靶點進行映射，取化合物和疾病靶點的交集，繪制Venn圖，取交集靶點作為目標靶點進行黃芪-半枝蓮治療肺癌的分子機制分析。用Cytoscape 3.7.1繪制化合物-靶點-疾病圖，用String[20]工具構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡并用Cytoscape 3.7.1展示。

1.4 MCODE聚類分析

MCODE是一種基于密度的多元蛋白質復合物算法，與直接用平均度值和介度中心性篩選關鍵靶點比較，MCODE可以從整體上把握靶點之間的關聯，是熵值較低的一種模塊劃分方法，且優于同類型Fuzzifier、Spectral clusters of protein sequences等算法[21]。利用MCODE插件進行聚類構建模塊，經過MCODE插件分析后獲得關鍵靶點(key target)。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

利用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)進行黃芪-半枝蓮藥對關鍵靶點的基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，使用R軟件以氣泡圖展示。其中，GO功能富集分析的BP為生物學過程、CC為細胞組成、MF為分子功能。使用ClueGO插件分別對黃芪治療肺癌的靶點和黃芪-半枝蓮藥對治療肺癌的共有靶點進行KEGG通路分析并繪制通路富集分析餅狀圖。

2 結果

2.1 黃芪-半枝蓮活性成分收集以及相應靶點預測

數據庫共篩選出黃芪-半枝蓮活性成分16種，見表1。預測靶點287個，中藥-化合物-靶點網絡圖見圖1。

注：藍色代表半枝蓮的主要成分；綠色代表黃芪的主要成分；紫色代表化合物的靶點。

表1 黃芪-半枝蓮活性成分

2.2 肺癌相關靶點收集以及靶點映射結果

在GeneCard數據庫中共找到21 901個肺癌相關靶點，收集關聯分數(relevance score)大于20的靶點。剔除無效靶點共得到肺癌相關靶點730個，與黃芪-半枝蓮287個靶點進行映射后得到111個目標靶點，見圖2。由圖2可知，黃芪-半枝蓮共同作用肺癌的靶點，其中黃芪-半枝蓮藥對共有的靶點34個，黃芪單獨作用于76個靶點，與中醫治療肺癌重視補虛、攻補兼施相一致。

圖2 黃芪-半枝蓮活性成分靶點與肺癌相關靶點交集

化合物-靶點-疾病網絡圖顯示圖中有128個節點和421條邊，見圖3。圖中節點越大，則度值(degree)越高，其中山奈酚的度值最高為87。度值較高的目標靶點有：前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(GSK-3β)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、白細胞介素6(IL-6)、血管內皮生長因子(VEGFA)、腫瘤壞死因子(TNF)等。

注：黃色代表疾病；紅色代表化合物；紫色代表靶點；節點越大代表度值越大，說明作用于此靶點的化合物越多。

2.3 目標靶點PPI網絡和聚類分析

進入String工具，輸入目標靶點，構建PPI網絡圖，見圖4(a),可知目標靶點的PPI網絡共111個節點。利用Cytoscape 3.7.1插件MCODE對PPI網絡圖中111個目標靶點進行聚類分析，得到55個關鍵靶點即圖4(a)中的黃色靶點，其PPI網絡圖見圖4(b)。其中，節點越大顏色越藍代表節點度值越大，節點越小顏色越黃代表節點度值越小，綠色節點是中間度值的節點。其中評分(MCODE Score)較高的10位分別是腫瘤蛋白53(TP53)、胱天蛋白酶-3(CASP3)、血管內皮生長因子-α(VEGFA)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、白蛋白(ALB)、轉錄因子AP-1(JUN)、促分裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、腫瘤壞死因子(TNF)、促分裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)。

(a)目標靶點的PPI網絡 (b)關鍵靶點的PPI網絡

2.4 GO與KEGG 富集分析

將2.3節篩選出的55個關鍵靶點輸入DAVID在線數據庫，進行關鍵靶點GO功能富集和KEGG通路富集分析，根據P值將結果排名前10的條目進行展示見圖5。本研究發現黃芪-半枝蓮生物功能主要富集在RNA轉錄和炎癥，生物過程主要富集在轉錄過程，細胞組成主要富集在胞外和胞核中。主要富集的信號通路有Toll樣受體(TLR)、NOD樣受體(NLR)、低氧誘導因子-1(HIF-1)、叉頭轉錄因子(FoxO)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶-B(PI3K-Akt)等。

注：節點顏色與P值有關，顏色越紅，可信度越高，即-lg P值越大；節點大小與富集靶點的數量有關，節點越大，富集靶點的數量(Gene Counts)越多。

ClueGO插件分別對黃芪-半枝蓮共有的34個靶點(圖6)和黃芪的110個靶點(圖7)，進行KEGG通路富集分析，將相關的信號通路用一個有概括性的典型信號通路表示，用以描述黃芪-半枝蓮靶點富集后偏重的信號通路類型，結果發現黃芪和半枝蓮共有的靶點通路都與IL-17相關的炎癥信號通路關系最為密切，其次是癌癥相關通路。而黃芪的靶點通路除了與炎癥關系密切還與免疫有關的人T細胞白血病病毒感染(human T-cell leukemia virus 1 infection)相關性大，其次是癌癥相關通路。

圖6 黃芪-半枝蓮共有靶點的通路富集分析餅狀圖

圖7 黃芪靶點的通路富集分析餅狀圖

3 討論

中醫學將肺癌歸于“肺積”“息賁”“積聚”等，認為肺癌是本虛標實，虛實夾雜之證。《外證醫案》云“正氣虛則成巖”。紀立秋[22]認為腫瘤發生發展的關鍵是“內虛”。《內經·靈樞》云“虛邪之人……久留而內著，邪氣居其間而不反，發為瘤”，說明邪毒聚集不散是癌癥發病的重要機制。因此，治療肺癌應遵循扶正解毒的原則。黃芪是最常用的補虛藥之一，又入肺經，《藥性歌訣》云“黃芪入藥，為強壯劑，具有益正氣，壯脾胃，排膿止痛，活血醫危的功效”。而半枝蓮有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛、抗癌等功能[23],因此，黃芪-半枝蓮藥對在治療肺癌方面有充足的中醫理論基礎。

3.1 化合物及靶點分析

現代醫學研究顯示，黃芪的主要成分山奈酚通過MAPK/ERK途徑影響MAPK、ERK、p38和JNK的磷酸化，實現抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[24]；通過抑制IL-4和COC-2的表達，下調NF-κB相關的炎癥反應[25]；還通過VEGF、HIF-1和依賴于CASP3凋亡通路等靶點從血管生成、細胞周期和細胞凋亡等途徑發揮抗癌活性[26-28]。MAPK、IL-4、VEGF、CASP3是本研究預測的山奈酚靶點，其中CASP3、VEGFA、MAPK是MCODE篩選出的關鍵靶點，在治療肺癌中有重要作用。MAPK、HIF-1信號通路在KEGG富集分析中分別位于第9位和第4位，說明了本研究的可靠性。黃芪另一成分刺芒柄花素通過STAT(信號轉導和轉錄激活蛋白)、PI3K/AKT和有絲分裂原激活的MAPK[29]等3條信號通路通過細胞凋亡和細胞周期相關因子抑制細胞增殖，此外，黃芪活性成分毛蕊異黃酮可以下調CCNA2、CDK2、CCNB1 等細胞周期相關蛋白，通過阻滯細胞周期，進而抑制細胞增殖[30]。綜上所述，黃芪主要成分可以通過VEGF、MAPK/ERK、HIF-1、PI3K/AKT等途徑抑制腫瘤細胞的惡性行為。

本研究顯示半枝蓮活性成分中靶點最多的是圣草酚，度值為21。現代藥理研究顯示圣草酚有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用；在炎癥方面，可能通過MAPKs信號傳導通路以及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥相關靶點，通過AKT/FoxO1信號通路抑制炎癥反應[31]。TNF、FoxO1和AKT信號通路在本研究的KEGG富集分析中分別位于第1位、第5位和第9位。

在上述靶點中，MAPK3存在于全部排名前十的信號通路中，AKT1在排名前十的信號通路中富集了9個，TNF富集了6個。這3個靶點都是治療癌癥的重要靶點，在腫瘤的發生發展過程中扮演了重要角色。因此，黃芪-半枝蓮藥對從血管生成、信號傳導、抗炎、抗氧化等多靶點、多途徑抑制了腫瘤細胞的惡性行為。

3.2 通路分析

本研究KEGG富集分析顯示黃芪-半枝蓮富集的信號通路主要有TLR、NLR、HIF-1、FoxO、PI3K-Akt等信號通路，這些信號通路已經被證實與肺癌的發生發展有關。其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9促使分泌多種炎性因子，通過發生炎癥反應，導致腫瘤的發生發展[32]。NLR家族與包括肺癌在內的19余種癌癥的發生發展相關[33]。缺氧可以促進腫瘤細胞惡性行為的潛能，HIF-1α高表達可激活腫瘤細胞的代謝、血管擴張、血管形成，使腫瘤易于侵襲、轉移[34]。轉錄因子FoxO1通過磷酸化、乙酰化等調節靶基因的表達，調控NSCLC細胞的凋亡、周期、DNA損傷修復等生物學過程來抑制NSCLC細胞生長[35]。PI3K-AKT通路在 NSCLC 的發生發展中具有雙重作用，一方面通過促進腫瘤細胞增殖和遷移導致腫瘤進展，另一方面通過參與免疫抑制微環境的形成介導腫瘤細胞的免疫逃逸[36]。因此，本研究預測黃芪-半枝蓮藥對通過多靶點抑制以上通路的表達抑制肺癌的發生發展。

此外，分別分析黃芪和半枝蓮的靶點相關通路(圖6、圖7)，發現兩者共有靶點主要與抗炎相關信號通路如TNF、MAPK、TLR和NLR信號通路相關。黃芪的靶點不僅與上述抗炎信號通路相關，還與免疫相關的信號通路有關，預測黃芪可提高免疫力的結論與中藥黃芪“補虛”這一理論相一致。因此，黃芪在抗炎和提高人體免疫力及抗腫瘤方面均有作用，與半枝蓮合用更加強了抗炎和抗腫瘤效果。

4 結論

本研究基于網絡藥理學方法對黃芪-半枝蓮藥對活性成分及其治療肺癌的機制進行了分析，發現黃芪-半枝蓮藥對的主要化合物成分如山奈酚、圣草酚、毛蕊異黃酮等有眾多靶點，如TP53、VEGFA、AKT1、MAPK、TNF、IL-6等，可能通過TNF、HIF-1、FoxO、TLR和NLR等通路在炎癥、血管生成等過程共同起到治療肺癌的作用。通過對黃芪和半枝蓮的靶點分析，發現黃芪從抗炎、抗腫瘤和免疫等方面抑制肺癌細胞惡性行為；黃芪與半枝蓮合用加強了抗炎和抗腫瘤的作用，為黃芪-半枝蓮治療肺癌的進一步實驗研究提供了理論基礎。