病證結(jié)合制備冷哮型哮喘模型大鼠的研究

趙 曄，柴茂山*，范 戈

(1.山西大同大學(xué)中醫(yī)藥健康服務(wù)學(xué)院，山西大同 037009；2.萬榮縣中醫(yī)醫(yī)院，山西萬榮 044200)

據(jù)統(tǒng)計全球72 億人口當(dāng)中，約每20 人中就有1例哮喘患者，總計約3 億多人。在中國，據(jù)估計哮喘患者可達2 000 萬以上。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療哮喘的過程中患者病情常反復(fù)發(fā)作，如不能加以及時有效控制，會嚴重影響患者的生活、學(xué)習(xí)及工作，甚者導(dǎo)致死亡。

中醫(yī)認為哮喘的病機主要是因痰飲之邪凝聚而無以溫化，終成夙根，伏藏于肺，再加之外邪的引動，而發(fā)為哮喘。哮喘與肺脾腎三臟關(guān)系密切，而痰飲伏藏則作為哮喘反復(fù)發(fā)作的主要內(nèi)因。《證治匯補》中較為明確地闡述了哮喘發(fā)病的病因病機，認為因胸中氣之壅塞，膈間又有頑痰之膠著，再有外寒之侵襲，導(dǎo)致氣道不暢，發(fā)為哮喘。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及分組

實驗動物：由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供的8 周齡SPF 級健康雄性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量180 ± 20 g，合格證編號為SCXK（京）2018-0016。實驗前期在清潔級動物飼養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，之后隨機分作正常對照組、冷哮模型組、中藥干預(yù)組，每組20只。

1.2 藥材和試劑

1.2.1 實驗藥材

所用中藥飲片（麻黃、桂枝、半夏、白芍、干姜、細辛、五味子、炙甘草）皆由北京同仁堂飲片責(zé)任有限公司提供。前期研究中細辛為9g的小青龍湯療效最好，因此復(fù)方中藥物劑量為：麻黃9 g，桂枝6 g，芍藥9 g，細辛9 g，干姜3 g，半夏9 g，五味子3 g，炙甘草6 g。換算大鼠的劑量：根據(jù)人和動物間按體表面積折算等效劑量，人的臨床劑量為X g/kg，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6倍，即大鼠的劑量＝6X g/kg。中藥干預(yù)組以劑量為4.8 g/kg，按藥量為相對濃度煎液1 mL/100g 每日給大鼠灌服小青龍湯水煎劑；對照組灌服等體積蒸餾水。

1.2.2 實驗試劑

美國Sigma 公司的卵白蛋白（OVA）干粉（批號：A6567）、浙江康樂藥業(yè)有限公司的0.9%氯化鈉注射液（批號：20180612）、天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司的氫氧化鋁粉末（批號：CNAB038-S）。

1.2.3 實驗儀器

瑞騰醫(yī)療器械股份有限公司的超聲霧化器（402A型）；日本東芝公司的全自動血細胞分析儀；德國賽多利斯的BS224S 萬分之一天平；大鼠霧化箱（60 cm ×50 cm×50 cm）；泳池（50 cm×40 cm×40 cm）。

2 實驗方法

2.1 造模方法

將60只大鼠隨機分作對照組、冷哮模型組[1-2]、中藥干預(yù)組，每組20 只。將各組大鼠第3～4 胸椎前后左右1～2 cm 處毛發(fā)用脫毛劑去除，每日將冷哮模型組、中藥干預(yù)組的大鼠在溫度為0 ℃左右氣候箱中進行時長20 min 外寒刺激，之后再放于冰水混合的泳池內(nèi)冰泳15 min。此2 組每日喂食冰凍的食物及冰水。實驗開始后分別于第1 天、第8 天、第15天，冷哮模型組和中藥干預(yù)組大鼠分別于腰部和腹腔各取2點注射氫氧化鋁和10%卵蛋白的混懸液，每處注射0.5 mL，總計2 mL；對照組大鼠注射生理鹽水2 mL。以上過程總計3 周。從第4 周起誘發(fā)哮喘，方法：將冷哮模型組、中藥干預(yù)組大鼠依次置于霧化箱內(nèi)，進行霧化處理（用1%卵蛋白60 mL 霧化，流量為5 mL/min），1 次/d，30 min/次，總計3 周；正常組大鼠生理鹽水霧化。

2.2 檢測指標(biāo)

一般體征：毛發(fā)色澤、口鼻分泌物、呼吸頻率及方式、腹肌狀況、肛溫與背心部溫度、四肢溫度及活動變化等。

血氣分析檢測：最后一次灌胃12 h 后，用注射器（肝素鈉反復(fù)沖洗）取大鼠左心室3 mL 血液，用血氣分析儀檢測動脈血P（O2）、P（CO2）。

病理檢測：剪開胸腔剝?nèi)『糠謿夤堋⒅夤艿挠曳谓M織，然后用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 一般體征

對照組各項體征均正常。冷哮模型組：呼吸困難、呼吸頻率增快、點頭式呼吸、打噴嚏、咳嗽、喘促，口唇發(fā)紺、口鼻分泌物增多，抓撓鼻、耳部，毛發(fā)零亂且無光澤，四肢、肛溫及背心溫度均降低，少動、扎堆、站立不穩(wěn)、腹部肌肉痙攣等。中藥干預(yù)組：上述癥狀逐漸減輕，無扎堆，毛發(fā)有光澤，口鼻部較干燥、無分泌物，咳嗽、喘促、打噴嚏次數(shù)減少，口唇發(fā)紺好轉(zhuǎn)，四肢、背心體溫及肛溫均恢復(fù)正常。

3.2 血氣分析測定

與對照組相比，大鼠的動脈血P（O2）在冷哮模型組顯著降低（P＜0.01），動脈血P（CO2）在冷哮模型組中顯著升高（P＜0.01）。與冷哮模型組相比，大鼠的動脈血P（O2）在中藥干預(yù)組中顯著升高（P＜0.01），但略低于正常組，動脈血P（CO2）在中藥干預(yù)組中顯著降低(P＜0.01)，但略高于正常組。

表1 大鼠血氣分析（n=15）

3.3 病理檢測

圖1 大鼠右肺組織病理切片

病理切片顯示（圖1）：對照見大鼠無異常改變。冷哮模型組主要表現(xiàn)為支氣管及肺泡間隔炎性細胞浸潤，其中支氣管管壁上皮組織細脫落、黏膜增厚、黏膜皺襞突出、平滑肌增生、周圍血管充血擴張，肺泡擴張、間質(zhì)瘀血、囊腫形成、間隔離斷等，終末氣道表現(xiàn)為炎性浸潤、水腫等。中藥干預(yù)組較模型組好轉(zhuǎn)，炎癥細胞浸潤減少，僅表現(xiàn)出氣道、黏膜少量炎性細胞浸潤，肺泡輕度擴張及輕度瘀血，而未表現(xiàn)出明顯細胞脫落、增生及支氣管管腔狹窄等。

4 討論

《癥因脈治·哮病》曰：“痰飲留伏，結(jié)成窠臼，潛伏于內(nèi)，偶有七情之犯，飲食之傷，或外有時令之風(fēng)寒，束其肌表，則哮喘之癥作矣。”指出哮喘病因為內(nèi)因痰飲久伏于肺、外則遇誘因或感邪引觸。哮病有寒熱之分，冷哮則最為常見。《靈樞·邪氣藏府病形》中記載：“形寒寒飲則傷肺，以其兩寒相感，中外皆傷，故氣逆而上行。”指出“寒飲”“形寒”均可傷及肺陽，以至陽的溫化水液功能失司，而致寒飲內(nèi)停。《素問·咳論》曰：“皮毛者，肺之合也。皮毛先受邪氣，邪氣以從其合也。其寒飲食入于胃，從肺脈上至于肺則肺寒，肺寒則外內(nèi)合邪，因而客之，則為肺咳。”指出寒飲入胃循經(jīng)而損傷肺陽，又因“外邪”相引，以至肺陽更損肺之宣肅失常而見咳喘。由此可見肺咳可因寒飲入胃而引起。故在造模中，以低溫環(huán)境及冰泳的方式造成“外寒”；以服食冰凍食物和飲用冰水造成內(nèi)停之“寒飲”，終致大鼠肺陽耗損，寒飲之內(nèi)停，加之外傷于寒邪，從而誘發(fā)冷哮。《痰飲咳嗽病脈證并治》曰：“水在肺，吐涎沫，欲飲水。”“夫心下有留飲，其人背寒如掌大。”故當(dāng)水飲停肺時，則出現(xiàn)吐涎、背寒等癥。

在研究關(guān)于細辛及小青龍湯的實驗中，課題組不斷完善冷哮型哮喘模型的建立途徑與方法。通過文獻查閱，在造模中借鑒其他課題研究中的有效方法，并對其改進，采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)哮喘模型的建立方法與傳統(tǒng)中醫(yī)的病因病機相結(jié)合，盡可能地建立出契合臨床中比較典型的冷哮病因癥候模型。

從實驗結(jié)果來看，模型組大鼠的癥狀與哮喘癥候極為相似，亦與中醫(yī)冷哮癥候有所相同。血氣分析檢測顯示：冷哮模型組與對照組相比，P（O2）在冷哮模型組降低顯著（P＜0.01），P（CO2）在冷哮模型組升高顯著（P＜0.01）；冷哮模型組與中藥干預(yù)組相比，中藥組P（O2）顯著升高（P＜0.01），而P（CO2）明顯降低（P＜0.01）。可見在造模過程中，大鼠出現(xiàn)組織缺氧和二氧化碳潴留，而中藥干預(yù)組提高了哮喘模型大鼠通氣功能，對冷哮有較好的改善作用。肺組織病理檢測顯示：冷哮模型組主要表現(xiàn)為支氣管及肺泡間隔炎性細胞浸潤，其中支氣管管壁上皮組織細胞脫落、黏膜增厚、黏膜皺襞突出、平滑肌增生，周圍血管充血擴張；其肺泡擴張、間質(zhì)瘀血、囊腫形成、間隔離斷等；終末氣道表現(xiàn)為炎性浸潤、水腫等。而經(jīng)過中藥干預(yù)之后，炎癥細胞浸潤減少，肺損傷有較好的緩解，僅表現(xiàn)出氣道、黏膜少量炎性細胞浸潤，肺泡輕度擴張及輕度瘀血，而未表現(xiàn)出明顯細胞脫落、增生及支氣管管腔狹窄等。以上均說明病證結(jié)合的方法可成功建立冷哮型大鼠模型，并且有很強的可靠性與可復(fù)制性。