miR-365通過調控ATG3對HCC細胞自噬的作用機制

王麗紅 吳慧麗 張利 李賓 劉迎

鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院1消化內科，2門診綜合診療中心（鄭州450000）

肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上最為常見的惡性腫瘤之一，具有較高發(fā)病率和致死率，嚴重威脅人類生命健康。臨床上治療肝癌常見的方式有手術切除、放射治療、免疫治療等，但HCC患者預后仍不理想［1］。自噬是細胞自我消化過程，可將細胞質內衰老或受損細胞器及一些大分子物質包裹在囊泡，形成自噬泡，與溶酶體融合，降解為小分子物質，對維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關重要［2］。自噬過程在細胞內受嚴格調控，不僅是細胞正常生理狀態(tài)下的生存機制，同時與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關［3］。在HCC發(fā)展過程中，自噬具有雙重作用，HCC發(fā)展初期，自噬可抑制腫瘤細胞生長，在發(fā)展階段，自噬可為腫瘤細胞提供營養(yǎng)促進腫瘤細胞增殖［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）參與基因表達與調控，與自噬過程密切相關，其通過對自噬水平的調控，影響腫瘤結局。miR-365是miRNA家族一員，在肝癌細胞中表達下調，但關于miR-365與HCC細胞自噬關系報道較少［5］。本研究通過探討miR-365在HCC中對自噬的作用及可能機制，旨在為治療HCC提供新的靶點和方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料選取本院收治確診為HCC患者13例，其中男性8例，女性5例，年齡26 ～61歲，平均年齡（41.37 ± 5.16）歲，收集患者術后HCC組織與癌旁組織，保存于液氮中。納入標準：年齡18歲；符合臨床HCC診斷標準，患者均接受根治術，術后經病理驗證為HCC。排除標準：無影像學資料及合并其他惡性腫瘤患者。

1.1.2 細胞系和試劑人肝癌SMMC-7721細胞、肝癌HepG2細胞，人正常肝細胞L02購于中國科學院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國Gibco公司），含有miR-365激動劑（miR-365-mimics）、無義隨機序列（miR-365-NC）的pcDNA3.1重組質粒（上海吉瑪制藥技術有限公司），兔抗人自噬相關基因3（autophagy related gene 3，ATG3）多抗、自噬微管相關蛋白輕鏈3-II（microtubule-associated protein1 light chain3-II，LC3-II）多抗、p62單抗、Beclin1單抗（美國Abcam公司），HRP標記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染及分組取人肝癌SMMC-7721細胞、肝癌HepG2細胞，人正常肝細胞L02，放入含有10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于體積分數5%CO2、37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。2 ～3 d傳代一次，取對數生長期SMMC-7721細胞，按1×105個/mL接種于6孔板，隨機分為對照組、NC組（轉染miR-365無序對照序列miR-365-NC）過表達組（轉染miR-365-mimics）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察轉染效率均＞85%，可用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR 檢測組織與細胞中miR-365、ATG3 mRNA 表達水平取患者HCC組織與癌旁組織，轉染與未轉染SMMC-7721細胞，HepG2肝癌細胞，人正常肝細胞L02，Trizol法提取總RNA，測定總RNA濃度和純度，逆轉錄cDNA，進行RT-qPCR。反應體系：上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，加ddH2O至總體積25 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，70 ℃延伸30 s，45個循環(huán)。miR-365以U6為內參，ATG3以β-actin為內參，采用2-CT法計算目的基因的相對表達水平。引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖情況各組細胞，按2 × 105個/mL接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，20 μL/孔加入MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h，150 μL/孔加入DMSO，震蕩10 min，用酶標儀在450 nm處檢測吸光度（A）值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況各組細胞按1 × 106個/mL接種于6孔板，培養(yǎng)48 h，胰酶消化，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，混勻，室溫避光孵育20 min，上流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.2.5 電鏡觀察細胞自噬情況取各組細胞按1×106個/mL接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后胰酶消化收集細胞，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加入4%戊二醛，4 ℃固定24 h，1%四氧化鋨4 ℃固定1 h，梯度乙醇和丙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片（片厚約100 μm），醋酸鈾和枸櫞酸鉛定位染色后封片，電鏡觀察。

1.2.6 Western blot 法檢測細胞中ATG3、LC3-II、Beclin1、p62蛋白相對表達水平取各組細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，BCA法定量，蛋白變性，上樣進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入1∶2 000稀釋的ATG3、LC3-II、Beclin1、p62一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗37 ℃孵育2 h，加入ECL曝光顯影，以β-actin為內參，采用Image J軟件進行灰度分析，計算目的蛋白相對表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-365 與ATG3靶向性根據生物信息學軟件分析預測miR-365與ATG3之間的結合位點，將ATG3-3′UTR插入熒光素酶報告載體pMIR-REPORT，分別構建野生型重組質粒pMIR-ATG3-MT和突變型重組質粒pMIR-ATG3-MUT，利用LipofectamineTM 2000轉染試劑將miR-365-mimcs-NC/miR-365-mimcs與野生組和突變組質粒共轉染SMMC-7721細胞，48 h后，檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC 患者組織與不同肝細胞系中miR-365 和ATG3 mRNA 表達情況HCC患者癌組織中miR-365、ATG3表達明顯低于癌旁組織（P ＜0.05），見圖1。肝癌SMMC-7721細胞、HepG2細胞中miR-365和ATG3表達均低于正常L02細胞（P ＜0.05），且SMMC-7721細胞較HepG2細胞更低（P ＜0.05），見圖2。后續(xù)實驗選擇SMMC-7721細胞。

2.2 SMMC-7721 細胞轉染后miR-365 和ATG3 mRNA 表達情況過表達組miR-365、ATG3相對表達量明顯高于對照組、NC組（P ＜0.05），見圖3。

圖1 HCC 患者不同組織miR-365、ATG3 表達情況Fig.1 The expression of miR-365 and ATG3 in different tissues of HCC patients

圖2 不同細胞系中miR-365、ATG3 表達情況Fig.2 The expression of miR-365 and ATG3 in different cell line

圖3 各組細胞miR-365、ATG3 相對表達量比較Fig.3 Comparison of relative expression levels of miR-365 and ATG3 in each group of cells

2.3 細胞增殖情況過表達組細胞A值明顯低于對照組、NC組（P ＜0.05）。見圖4。

2.4 細胞凋亡情況過表達組細胞凋亡率明顯高于對照組、NC組（P ＜0.05），見圖5。

圖4 各組細胞A 值比較Fig.4 Comparison of cell A values in each group

圖5 各組細胞凋亡率比較Fig.5 Comparison of cell apoptosis rate in each group

2.5 透射電鏡觀察結果透射電鏡觀察顯示，對照組、NC組內質網、溶酶體等細胞器結構正常；過表達組出現大小不一、包裹細胞器的圓形自噬泡（箭頭指示），見圖6。

2.6 細胞中ATG3、LC3-II、p62、Beclin1 蛋白相對表達量過表達組細胞中ATG3、LC3-II、Beclin1蛋白相對表達量明顯高于對照組、NC組，p62蛋白相對表達量明顯低于對照組、NC組（P ＜0.05），見圖7。

圖6 透射電鏡觀察自噬（×25 000）Fig.6 Observation of autophagy under transmission electron microscope（×25 000）

圖7 細胞中ATG3、LC3-II、p62、Beclin1 蛋白表達Fig.7 Protein expression of ATG3，LC3-II，p62，Beclin1 in cells

2.7 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-365 與ATG3 靶向性生物學信息軟件顯示，ATG3存在miR-365結合位點，見圖8A；進一步熒光素酶實驗顯示，轉染miR-365 mimics可明顯抑制野生型ATG3相對熒光素酶活性（P ＜0.05），而對突變型ATG3無明顯影響（P ＞0.05），見圖8B。

圖8 miR-365 靶向調節(jié)ATG3 表達（A：miR-365 與ATG3 存在連續(xù)結合位點；B：miR-365 靶向抑制ATG3）Fig.8 miR-365 targeted regulation of ATG3 expression（A：miR-365 and ATG3 have continuous binding sites；B：miR-365 targeted inhibition of ATG3）

3 討論

自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程關系密切，通過探討腫瘤細胞自噬的分子機制，對治療腫瘤具有重要意義［6］。自噬通過降解細胞組分，為細胞提供營養(yǎng)物質，維持細胞正常代謝，并可防止化療藥物誘導的細胞凋亡，保護細胞免受藥物作用，促進細胞耐藥；另一方面，自噬也可導致細胞死亡，通過誘導自噬促進細胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用，在治療癌癥中具有潛在效應［7］。miRNA參與調控基因表達，通過調節(jié)自噬過程中關鍵蛋白的表達，對腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移過程表現出直接或間接調控作用，從而發(fā)揮抑癌或促癌作用，為腫瘤的治療提供新靶點和新思路［8］。

miRNA在腫瘤組織中通過上調或下調下游相關基因，對腫瘤的結局和預后產生不同影響［9］。不同腫瘤組織中miR-365表達存在差異，其在皮膚鱗狀細胞癌中表達上調，在肺癌、口腔鱗狀細胞癌細胞中低表達［10-12］。HE等［13］報道顯示，miR-365在HCC癌組織表達明顯低于癌旁組織，miR-365下調可通過多種途徑促進HCC進展和轉移。本研究通過檢測HCC患者癌組織與癌旁組織中miR-365表達，結果顯示癌組織中miR-365表達顯著低于癌旁組織，與以上結果一致。為進一步證實miR-365在HCC中的表達，本研究對不同HCC細胞系及正常肝細胞系中miR-365表達情況進行檢測，結果顯示，HCC細胞系中miR-365表達明顯低于正常肝細胞，進一步驗證miR-365在HCC中低表達。為揭示miR-365在HCC中作用機制，本研究采用miR-365轉染SMMC-7721細胞，結果顯示，miR-365過表達后，細胞增殖能力降低，凋亡率升高，與JIANG等［14］研究結果一致，提示過表達miR-365可抑制HCC細胞增殖促進其凋亡。

過表達miR-365可誘導HCC細胞凋亡，阻止原發(fā)性腫瘤生長，通過誘導自噬促進HCC細胞凋亡是抑癌的重要分子機制之一［15-16］。在肥大型心肌細胞中，miR-365表達顯著上調，可負向調控心肌細胞自噬，引起自噬失調［17］。細胞自噬受機體多種基因和蛋白嚴密調控，參與調控自噬的基因統(tǒng)稱為ATG家族，其中ATG3參與調節(jié)LC3蛋白脂化系統(tǒng)［18］。LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，發(fā)生自噬時，Ⅰ型經泛素樣修飾轉變成Ⅱ型，LC3-Ⅱ含量與自噬泡數量成正比，是發(fā)生自噬的標志性蛋白。Beclin1是自噬啟動因子，其活性下降或缺失抑制自噬的啟動，促進腫瘤進展。p62蛋白是自噬負性調控因子，參與調節(jié)自噬降解途徑。本研究轉染miR-365后，透射電鏡提示細胞發(fā)生自噬，進一步經Western blot檢測，結果顯示過表達miR-365后，ATG3、LC3-II、Beclin1蛋白表達升高，p62蛋白表達下降，提示過表達miR-365抑制SMMC-7721細胞增殖促進細胞凋亡，可能與誘導細胞發(fā)生自噬有關。

miR-365下游有眾多靶基因，通過調節(jié)不同靶基因表達，發(fā)揮相應生物學功能［19］。本研究通過miR靶基因預測軟件預測miR-365與ATG3存在相互結合位點，經雙熒光素酶實驗驗證miR-365與ATG3之間存在靶向性，與YANG等［20］研究結果一致，由此推測，過表達miR-365可能是通過靶向促進ATG3表達，激活細胞自噬，誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。

綜上所示，過表達miR-365可誘導HCC細胞自噬，從而抑制細胞增殖促進其凋亡，其可能是通過靶向上調ATG3表達，調節(jié)細胞自噬水平，為臨床治療HCC提供新的治療靶點。