非小細胞肺癌免疫治療相關生物標記物的研究進展

劉光峨，馬虎

遵義醫科大學第二附屬醫院，貴州遵義 563000

近年來，免疫檢查點抑制劑(ICI)在非小細胞肺癌(NSCLC)治療中取得突破性進展，已被美國食品藥品管理局 (FDA) 批準用于癌癥的診療。大量的臨床試驗表明，ICI能顯著改善腫瘤患者的生存狀況，然而在未經選擇治療人群中也只有少部分患者能從中獲益。相比較傳統的化療來說，ICI的毒副反應較低，但也會導致嚴重的自身免疫性毒性[1]。因此如何通過精準預測性標志物篩選更適合免疫治療的患者，實現個體化免疫治療尤為重要。本文對肺癌免疫治療相關生物標記物如程序性死亡蛋白-1(PD-1)、程序性死亡蛋白配體-1(PD-L1)、新抗原及腫瘤突變負荷 (TMB)、微衛星不穩定性 (MSI)、錯配修復缺陷 (dMMR)、驅動基因突變及腸道菌群等的研究現狀作一綜述。

1 PD-L1

研究證實，PD-L1能作為生物標記物用于晚期非小細胞肺癌的診療，PD-1或PD-L1抑制劑在NSCLC患者中的療效與腫瘤細胞PD-L1的表達水平相關?；谙嚓P研究結果，FDA批準對于PD-L1 腫瘤細胞陽性比例分數(TPS)表達≥50%且無明確驅動基因突變初診的NSCLC患者可以一線選擇pembrolizumab。作為首個以總生存期(OS)為主要終點的研究發現，在PD-L1 TPS陽性(≥1%)且無EGFR/ALK突變的NSCLC患者中，免疫治療能顯著改善 PD-L1表達不同水平NSCLC患者的 OS，再次證明了PD-L1的表達與pembrolizumab療效相關性。2019年美國臨床腫瘤學會會議公布了一項研究的5年生存結果[2]，初治患者PD-L1 TPS表達水平≥50%，5年生存率達29.6%；PD-L1 TPS表達水平1%～49%，5年生存率為15.7%。經治患者中PD-L1 TPS≥50%的患者5年生存率為25%，PD-L1 TPS 1%～49%的患者為12.6%，而在<1%的患者為3.5%。2019年NCCN指南將PD-L1檢測力度從2A級升至1級。盡管如此，PD-L1的表達依然不能很好的預測免疫檢測點抑制劑的療效。

在部分研究中并沒有發現PD-L1表達與ICI反應或OS有相關性[3],導致此結果的可能潛在原因包括不同檢測方法、PD-L1表達時間、評估陽性率非標準化標準和chutff值等多種因素。如FDA獲批了8種PD-1、PD-L1抑制劑，卻對應了5種PD-L1抗體；判讀指標3種，即TPS、聯合陽性分數(CPS)、IPS；對于不同癌種，cutoff值還分別不同。值得注意的是目前尚無抗體獲得中國國家藥品監督管理局批準用于臨床檢測，免疫組織化學診斷結果的判讀標準及PD-L1報告規范仍沒有達到共識。除以上因素外，由于瘤內異質性的原因，PD-L1在相同組織不同區域的表達也不一樣。同時PD-L1表達是動態變化過程，基于不同治療PD-L1的表達變化不同。NSCLC 患者接受輔助化療后PD-L1表達會增高，使用吉非替尼治療的后PD-L1表達會下調。此外，許多PD-L1表達較低或無法檢測到的患者獲得了持久臨床療效[4]，同時也有相當一部分PD-L1陽性表達患者對免疫治療無反應。因此，PD-L1狀態可能不是臨床治療決策的一個足夠全面的獨立生物標志物。

目前PD-L1仍是免疫治療中最常用的生物標記物，但PD-L1的表達與多種因素相關。PD-L1的表達不是單純的“有”和“無”的關系，其在人群中的分布是連續性的，在不同的瘤種甚至同一腫瘤患者不同時間點的表達是一個動態變化過程。在某一時間點的檢測值可能并不能完全反映整體的實際情況，可能需要結合其他反映免疫反應的因素進行分析。規范的病理診斷和報告標準及如何正確理解PD-L1的表達對免疫治療的指導意義，是目前臨床工作者面臨的共同問題。

2 新抗原及TMB

體細胞在各種誘變劑如細菌、病毒、電離輻射、紫外線、有毒化學藥品、吸煙等作用下發生突變。突變或異常表達的蛋白被加工成與主要組織相容性抗原MHC Ⅰ類分子結合或不能結合的肽，能與MHC高親和性結合的肽段成為免疫原性肽，從而引發隨后的免疫反應。約1%的免疫原性肽能被腫瘤患者體內的T細胞識別即形成新抗原而引發免疫反應。TMB指的是每百萬個堿基中的體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數。理論上TMB越高，新抗原就越多，越有可能刺激產生免疫應答，免疫治療的效果會越好。有研究發現TMB能作為 nivolumab單抗療效預測的生物標志物，隨后Ⅱ期研究[5]及Ⅲ期研究[6]均表明，nivolumab聯合ipilimumab對比化療, 在高腫瘤突變負荷 (TMB≥10個突變/Mb) 患者人群中有更顯著的生存獲益且與PD-L1表達水平無關。 Kowanetz 等對納入患者通過 FoundationOne 平臺檢測其組織 TMB(tTMB)分析相關數據后發現，高 tTMB 患者均可獲得較好的 ORR、OS 及 PFS。b-F1RST研究[7]顯示，血液TMB (bTMB)≥16 mut/Mb組患者atezolizumab療效更優。2019年斯隆凱特林癌癥紀念中心研究團隊分析了1 662例接受ICI治療的晚期癌癥患者和5 371例非ICI治療患者的臨床和基因組數據測序，發現在這些患者中不論何種組織來源，TMB 處于最高20%分位時，患者能夠從ICI治療中獲得長期生存獲益[8]。

目前，TMB一般以非同義突變總數或每1兆堿基(1 Mb)的突變數量來表示，檢測方法為基因組分析，檢測項目分為全基因組測序、全外顯子組測序和選擇性基因測序?！敖饦藴省睘槿怙@子測序，但其測序時間長且價格昂貴。因此，目前臨床應用廣泛是選擇性基因測序，與全基因組、全外顯子組測序相比，其準確率達95%以上。早在2013年，Alexandrov等對來自30種腫瘤的7 042個樣本進行檢測，發現TMB從兒科腫瘤(0.001/Mb)到惡性黑色素瘤(400/Mb)呈多樣性分布,且同一腫瘤不同患者之間的TMB也盡相同。Chowell等[9]指出，部分低TMB患者也能對免疫治療產生應答，高TMB患者也未必表現很好的免疫治療療效。

雖然支持TMB作為免疫治療生物標記物的證據正在不斷擴充，但臨床使用這種生物標記物的方式與PD-L1相同，并沒有用它來確定給予或拒絕免疫治療。即便患者的PD-L1染色很低，如果醫生判斷患者進行免疫治療是一個好的治療選擇也會照此治療，所以臨床工作者需要考慮更多的決策因素。TMB亦然，目前它并不是患者進行治療的決定因素，但它是醫生要考慮的眾多因素之一。有關TMB的檢測方法、高或低“負荷”界值、不同平臺的檢測基因數目、檢測周期、臨床藥物指導的前瞻性研究及不同腫瘤的TMB 標準是否相同等問題的答案尚待進一步探索。

3 MSI及dMMR

微衛星又稱簡單重復序列，是一些短而重復的DNA序列，一般由1～6個核苷酸組成，串聯重復排列。DNA復制時插入或缺失突變引起的微衛星序列長度改變的現象，常由dMMR引起，稱為MSI。當腫瘤細胞中存在 dMMR、MSI時，腫瘤細胞內將累積大量基因突變，某些突變(新抗原)有可能被免疫系統識別和攻擊，達到更好的免疫治療效果。2017年，pembrolizumab被FDA批準用于治療高MSI(MSI-H)、dMMR的成人和和兒童實體瘤患者，這是FDA首次基于生物標志物數據而非組織位點批準的治療方法[10]。 已有研究證實，接受納武單抗聯合伊匹單抗治療存在 dMMR 或 MSI-H 轉移性結腸直腸癌患者療效較好。因此，目前NCCN指南推薦pembrolizumab用于dMMR、MSI-H結直腸癌、子宮內膜癌等實體腫瘤晚期治療，推薦nivolumab用于dMMR、MSI-H 結直腸癌晚期治療。在所有實體瘤中，具有MSI-H基因表型的腫瘤不足1%，在最常見的結直腸癌MSI-H基因表型腫瘤也僅有 5%～8%。MSI-H基因表型在肺癌中的發生率很低，因此MSI-H、dMMR對肺癌免疫治療療效的預測價值有待考證。

4 腫瘤驅動基因突變

表皮生長因子受體(EGFR)通路與PD-1/PD-L1通路的關系密不可分。有研究表明，EGFR突變或ALK重排的NSCLC患者對免疫治療并沒有表現出明顯的反應[11]。一項納入551例晚期NSCLC患者的回顧性研究結果顯示，ICI單藥使用的EGFR及ALK突變陽性的患者無進展生存期(PFS)分別為2.1及2.5個月，無OS獲益；在EGFR突變亞型中對使用PD-1/L1抑制劑同樣沒有顯示出確切的療效[12]。Lee等研究顯示，在EGFR突變組ICI對比多西他賽二線治療晚期NSCLC無OS獲益。有研究提示，EGFR、ALK、ROS-1和RET突變NSCLC患者TMB較低，PIK3CA和KRAS突的NSCLC患者TMB較高，使用ICI治療的效果較好[13]。TP53突變/STK11野生型NSCLC患者使用ICI治療，PFS延長，SKT11與ICI療效呈負相關，BRAF及C-MET與ICI療效呈正相關[14]。在atezolizumab一線治療的BIRCH研究和二線治療的OAK研究中，EGFR突變亞組分析也發現野生型的患者療效要優于突變型。 但是使用nivolumab治療患者，雖然EGFR突變陽性患者療效不佳，但是仍有部分患者明顯獲益，具體機制尚需進一步研究。 在2019年更新的NCCN指南將pembrolizumab一線治療NSCLC的使用條件中去除了ROS-1、BRAF陰性或未知，仍保留了EGFR、ALK突變陰性。因此，免疫治療對驅動基因陽性患者療效如何目前仍在探索中。

5 腫瘤微環境炎癥及免疫效應標志物

腫瘤的發生發展是復雜的免疫過程，免疫微環境及免疫效應細胞在其中起著不可忽視的作用，能進入腫瘤微環境介導抗腫瘤免疫反應的免疫細胞如細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞，稱為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。有研究指出，免疫治療獲益的NSCLC患者CD8+T淋巴細胞的數量較無反應的患者高。一項使用ICI治療黑色素瘤的回顧性研究中發現，CD8+TIL增高比例與OS顯著相關，但CD4+TIL數量與PD-1抑制劑的療效未見相關性。Teng等[15]根據 TIL和PD-L1表達情況將腫瘤微環境分為4種類型 。Ⅰ型(適應性免疫抵抗型)：PD-L1使得TLT“耗竭”，促進腫瘤產生適應性免疫耐受，可通過ICIs激活效應細胞功能，因此Ⅰ型更易于從PD-1/PD-L1抑制劑治療中獲益。Ⅱ型(免疫忽視型)：不表達PD-L1和TIL，效應T細胞不能浸潤到腫瘤組織中，表現為免疫無能。Ⅲ型(內在誘導型)：存在PD-L1但無TIL，ICIs對此無效，可通過促進T細胞提高療效。Ⅳ型(免疫耐受型)：有TIL無PD-L1表達，說明存在其他因素導致免疫耐受，需要去除這些因素。外周血中炎癥相關標記物如中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)、淋巴細胞計數、中性粒細胞計數及C反應蛋白(CRP)等與ICI療效相關[16]。接受nivolumab治療前,NLR<5較NLR≥5的患者PFS和OS顯著延長，接受nivolumab治療2周和4周時NLR<3患者較NLR≥3患者PFS顯著延長[17]?；€CRP值NSCLC患者接受nivolumab治療的PFS及OS呈負相關，CRP<1mg/dL的患者表現出顯著延長的PFS及OS[18]。

6 腸道菌群

人類腸道菌群種類大約有30個屬，300～500多種，數量約在1×1014個，是人體細胞總數的10倍。其編碼的基因總數是人體基因總數的100倍，被稱為人體的"第二基因"，并且有65%～70%的免疫細胞定位在腸道，因此腸道又是人體內最大的免疫器官。大量文獻報道腸道微生物的變化可以影響機體免疫狀態，微生物調控有望成為腫瘤免疫療法的重要組成部分。Sivan等研究發現，PD-1/PD-L1療效與腸道內雙歧桿菌顯著相關。Routy 等[19]發現在接受免疫檢查點抑制劑治療前2個月內或者治療后1個月內接受廣譜抗生素治療患者，PFS、OS 都相對較未接受抗生素治療患者更短。同時發現AKK菌普遍存在于接受過 ICI 治療之后達到療效緩解患者體內，而抗PD-1療法治療效果很差的患者，體內缺乏這種細菌。將無應答患者的腸道菌群移植到小鼠模型后，同時補充這種細菌，則小鼠能重新獲得免疫應答。這項研究清楚地支持了腸道菌群對于抗 PD-1 免疫療法的重要性。其他研究發現在免疫檢查點抑制劑使用前30 d內使用β內酰胺和氟喹諾酮類抗生素可能影響療效。Gopalakrishnan等[20]以 112 例接受過抗 PD-1 免疫療法的晚期黑色素瘤患者為研究對象，分析了患者糞便中微生物的多樣性，發現腸道菌群與 PD-1 抗體的療效有關。對 PD-1 抗體治療有反應患者與沒有反應患者腸道菌群明顯不同，PFS 獲益者體內普遍存在 faecalibacterium 和 clostridiales 兩種細菌。腸道菌群多而雜，與飲食、生活習慣、居住環境、基因等多種因素相關，且目前的檢測方法只能大概的歸類到“屬”。如何改變腸道菌群組成使得抗癌藥物有效率更高、如何區分腸道中可以引發自身免疫疾病的菌群、腸道菌群與宿主的關系、腸道菌群-代謝-癌癥的關系模式、腸道菌群與宿主相互作用的具體機制，仍需要大量的研究。

綜上所述，腫瘤免疫是一個極其復雜的過程，涉及腫瘤基因組學及腫瘤應答、腫瘤基因組的突變特征及宿主基因組學、腫瘤免疫微環境、共棲微生物等多個方面。免疫檢查點抑制劑治療腫瘤其效果除與腫瘤細胞免疫抑制信號的解除有關外，還與腫瘤免疫刺激信號強弱、免疫效應細胞功能的發揮及其他免疫抑制信號途徑的活動有關，機制相對復雜。PD-L1及TMB是目前免疫治療獲益相對較強的生物學標記物，其他如驅動基因、MSI、dMMR及腸道菌群等生物標記物仍在研究的早期階段。目前想要尋找單一而全面的療效預測指標可能不容易實現。在臨床診療中，多個指標綜合判斷及建立有效的預測生物學模型有助于更好地運用免疫治療。