苯乳酸和醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌的協同抑菌機理

寧亞維，付浴男，何建卓，蘇 丹，侯琳琳，王志新，賈英民*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048)

單核細胞增生李斯特菌是一種革蘭氏陽性桿狀細菌，廣泛存在于熟食肉類、軟奶酪、牛奶和其他乳制品中[1]，能引發食源性疾病，包括敗血癥、流產、中樞神經系統功能障礙和胃腸炎等[2]。例如在美國，單核細胞增生李斯特菌每年導致約1 600 例疾病[3]；僅2015年歐洲28 個成員國由單核細胞增生李斯特菌導致的疾病就有2 206 例[4]。此外，單核細胞增生李斯特菌能夠在食品加工環境如冷藏、高鹽、高pH值環境中長期存在[5-7]，甚至黏附在食品加工設備的表面，形成難以去除的生物膜[8]。因此，有必要研究抑制食品中單核細胞增生李斯特菌的生長以提高食品的安全性。

苯乳酸是近年來發現的一種新型抑菌物質[9]，具有廣譜抑菌活性，不僅對金黃色葡萄球菌[10]、腸道沙門氏菌[11]、埃希氏菌、單核細胞增生李斯特菌[12]等多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用，對青霉、黑曲霉、黃曲霉等真菌以及滑念珠菌、膠紅酵母等酵母同樣有良好的抑制作用[13-14]。此外，苯乳酸對細胞和動物無毒[15-16]。因此，苯乳酸具有較高的應用潛力。

苯乳酸對單核細胞增生李斯特菌具有較好的抑菌特性，其相關抑菌特性研究主要針對苯乳酸單獨使用的抑菌機理。Dieuleveux等[10,17]率先報道了苯乳酸對單核細胞增生李斯特菌的抑菌活性，并發現細胞壁為苯乳酸的抑菌靶位；本課題組前期研究發現苯乳酸對單核細胞增生李斯特菌的細胞膜和DNA均產生破壞作用[12]；Sorrentino等[18]發現苯乳酸對單核細胞增生李斯特菌的抑菌靶位主要在細胞表面和細胞質膜中，從而導致細胞結構破裂。本課題組前期通過研究苯乳酸與防腐劑聯用的抑菌效果，發現苯乳酸與苯甲酸鈉、山梨酸鉀等常用防腐劑聯用對大腸桿菌具有協同抑菌效應，然而其與苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸乙酯、乳酸鏈球菌素、聚賴氨酸等多種防腐劑聯用對單核細胞增生李斯特菌均不產生協同效應[19]。后續本課題組經過擴大聯合抑菌劑篩選范圍，發現醋酸與苯乳酸聯用可以增強其抑菌活性，該發現與Rodríguez等[11]報道的苯乳酸與有機酸共存時能增強其抑菌活性的結果一致。然而具體的聯合抑菌效應及機制尚鮮有報道。由于醋酸來源廣泛、經濟易得，不僅可以作為酸度調節劑使用，還可作為防腐劑添加到食品中，在食品體系中具有較好的應用價值。因此，本研究考察了苯乳酸和醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌的抑菌機制，以期為苯乳酸在食品防腐中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

單核細胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes10403S由河北科技大學食品與生物技術安全實驗室保藏；苯乳酸、DiSC3(5) 美國Sigma公司；LIVE/DEAD試劑盒美國Thermo Fisher Scientific公司；Minibest細菌基因組DNA提取試劑盒 日本Takara公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

F-7000-FL 220熒光分光光度計、S-4800-I掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Accuri C6 plus流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Evolution 220紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；Gel DocTMXR＋凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度及聯合抑菌指數的測定

苯乳酸和醋酸的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）使用肉湯微量二倍稀釋法測定。取培養至對數期的單核細胞增生李斯特菌，調整細菌濃度為1×106CFU/mL備用。在96 孔板第一列分別加入20 mg/mL的苯乳酸和醋酸，再用營養肉湯在第2～10列進行系列梯度稀釋。然后在每個孔注入100 μL的菌液。第11列不加抑菌劑，只加100 μL營養肉湯及100 μL菌液，第12列只加200 μL 營養肉湯作陰性對照。之后于37 ℃恒溫培養箱培養24 h后通過酶標儀測定吸光度，以細菌被抑制的最低抑菌劑濃度作為MIC。

根據Fratini等[20]的方法測定苯乳酸與醋酸部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）。制備質量濃度范圍為1/8～4 MIC的苯乳酸和醋酸二倍稀釋菌液備用。然后，將100 μL的苯乳酸以水平方向添加到96 孔板中，并將相同量的醋酸以垂直方向添加到96 孔板中。最后將每孔含有不同質量濃度的試劑與100 μL細菌培養液（106CFU/mL）混合，并在37 ℃下培養24 h。按下式計算FICI。

1.3.2 時間-殺菌曲線的繪制

將培養至對數期的單核細胞增生李斯特菌接種到新鮮營養肉湯中，使其濃度為106CFU/mL，然后加入不同質量濃度的抑菌劑，分別為1/4 MIC、MIC的苯乳酸，1/2 MIC、MIC的醋酸，以及1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸，然后于37 ℃恒溫培養箱培養。在適當的時間點取樣并采用平板計數法測定培養活菌數。以時間為橫坐標，活菌數的對數值為縱坐標繪制時間-殺菌曲線。

1.3.3 單核細胞增生李斯特菌Zeta電位的測定

采用馬爾文激光粒度儀考察了苯乳酸、醋酸對單核細胞增生李斯特菌Zeta電位的影響。取生長對數期的單核細胞增生李斯特菌，4 700×g離心10 min，用無菌超純水清洗重懸，調節菌體濃度至2×108CFU/mL。取1 mL菌懸液分別與1 mL不同質量濃度抑菌劑等體積混勻，用超純水作空白對照，以pH 3的HCl溶液作陽性對照，在37 ℃下孵育1 h后用馬爾文激光粒度分析儀進行電位檢測。

1.3.4 單核細胞增生李斯特菌膜電位的測定

采用DiSC3(5)考察苯乳酸、醋酸對單核細胞增生李斯特菌膜電位的影響。收集對數期的細菌，清洗并用5 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.2～7.4，含10 mmol/L葡萄糖）重懸至2×108CFU/mL。然后，將DiSC3(5)加入到細胞懸液中，使其終濃度為1 μmol/L，于30 ℃黑暗條件下溫育15 min。之后清洗、重懸，并加入KCl，使其終濃度為100 mmol/L，以平衡細胞質和外部鉀離子濃度。最后，用等體積的抑菌劑與菌懸液于比色皿中混勻，以纈氨霉素（18 mmol/L）處理組作為陽性對照，尼日利亞菌素（2 mmol/L）處理組作為陰性對照，在激發波長650 nm、發射波長672 nm條件下測定熒光強度變化。

1.3.5 單核細胞增生李斯特菌細胞膜完整性的分析

采用熒光顯微鏡考察了苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌細胞膜完整性的影響。收集對數期的單核細胞增生李斯特菌，清洗、重懸，調整細菌濃度為2×108CFU/mL，將等體積的菌懸液與不同濃度抑菌劑混合，未用苯乳酸和醋酸處理的樣品作為陰性對照，用體積分數70%異丙醇溶液處理的樣品作為陽性對照，并在37 ℃孵育60 min。然后通過離心收集細胞，清洗、重懸以除去抑菌劑，并在黑暗條件下用2 μmol/L SYTO9和12 μmol/L碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色15 min。之后清洗、重懸，菌體采用熒光顯微鏡觀察和Accuri C6 Plus流式細胞儀分析。

1.3.6 單核細胞增生李斯特菌微觀形態的觀察

采用掃描電子顯微鏡考察單核細胞增生李斯特菌外部形態的變化。將收集好的細胞用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗后，在4 ℃下用體積分數2.5%戊二醛溶液固定過夜。然后用乙醇（體積分數分別為30%、50%、70%、85%、90%、100%）進行梯度脫水，每次15 min，無水乙醇脫水兩次。之后用乙酸異戊酯將乙醇置換兩次，冷凍干燥后通過掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.7 瓊脂糖凝膠阻滯電泳分析

采用瓊脂糖凝膠阻滯電泳考察苯乳酸和醋酸對細菌基因組DNA的影響。將單核細胞增生李斯特菌培養至對數期，然后用Minibest細菌基因組DNA提取試劑盒按試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，之后用Evolution 220紫外分光光度計測定DNA的濃度及純度。將純度合格（OD260nm/OD280nm＝1.98）的DNA與不同濃度的抑菌劑作用后，用1%瓊脂糖凝膠電泳考察DNA在瓊脂糖中的遷移率。電泳指示條帶在1×TAE緩沖液中遷移至整塊膠板4/5后用凝膠成像系統進行觀察分析。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復3 次取其平均值，采用Origin Pro 8軟件對實驗結果進行統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 苯乳酸和醋酸對單核細胞增生李斯特菌的抑菌活性

苯乳酸和醋酸對單核細胞增生李斯特菌的MIC分別為2.25、1.75 mg/mL，FICI為0.5，表明苯乳酸和醋酸對單核細胞增生李斯特菌具有協同效應，同時表明醋酸對單核細胞增生李斯特菌的抑菌效果強于苯乳酸。根據實驗結果選取1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯用，并采用時間-殺菌曲線進行抑菌性的驗證。通過圖1中的時間-殺菌曲線實驗結果可以看出，用1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理單核細胞增生李斯特菌24 h后，菌落數分別增加了3.6（lg（CFU/mL））和2（lg（CFU/mL）），結果與空白組（增加了3.6（lg（CFU/mL）））相似。而MIC苯乳酸、MIC醋酸及二者聯用處理單核細胞增生李斯特菌后，24 h菌落數處于穩定狀態，和初始值相比，分別下降了1.6、1.4、1.2（lg（CFU/mL））。此外，聯用組與1/4 MIC苯乳酸組相比，24 h后，其活菌數減少超過2（lg（CFU/mL）），根據Jacqueline等[21]的評估方法，1/4 MIC的苯乳酸與1/2 MIC的醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌呈現出協同抑菌效應。多項報道顯示，有機酸與抑菌劑聯用可以發揮協同增效抑菌作用，如乙酸（0.10%，體積分數）和百里酚（100 mg/L）或香芹酚（100 μL/L）聯用對鼠傷寒沙門氏菌呈現協同抑菌作用[22]；乳酸和抗壞血酸聯用對大腸桿菌O157:H7具有協同抑制效應[23]。

圖1 苯乳酸、醋酸對單核細胞增生李斯特菌的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-killing curve of L.monocytogenes when exposed to PLA and ACE

2.2 苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌Zeta電位的影響

Zeta電位反映了細菌表面凈電荷分布情況，即細菌表面與周圍介質的電位差。從圖2可以看出，未處理的細菌其Zeta電位為負值，這是由于存在羧基和磷酸鹽等陰離子基團[24]。苯乳酸和醋酸單一處理組細胞表面的電荷發生較大的改變，電性甚至由負電變為正電，可能是苯乳酸和醋酸電離產生大量的氫離子基團導致電性改變。而苯乳酸和醋酸聯用組和陽性對照組的電性表現結果一致，即細胞電荷發生改變，但電性仍然為陰性，說明聯用對細胞表面電荷的影響受到苯乳酸和醋酸共同的作用但又不同于二者單獨作用。苯乳酸和醋酸及其聯用組的pH值在3.0±0.3范圍內，但結果顯示3 個實驗組在誤差pH值范圍內對電荷有不同的影響，說明除了氫離子濃度（pH值）導致細菌表面電荷發生變化外，還可能由于苯乳酸及醋酸使菌體表面其他官能團被電離從而導致細胞表面電荷發生變化而達到抑菌目的。Wang Chenjie等[25]發現乳酸處理單核細胞增生李斯特菌可導致其Zeta電位變為較小的負值，甚至轉變為正值，即乳酸會嚴重干擾單核細胞增生李斯特菌的表面電荷。表明苯乳酸、醋酸對單核細胞增生李斯特菌表面電荷的影響與乳酸相似。此外，Young等[26]研究乙酸、乳酸和檸檬酸對單細胞增生李斯特菌生長的抑制作用時發現，等pH值的有機酸對單細胞增生李斯特菌的抑制強度不同，強度順序為乙酸＞乳酸＞檸檬酸，該研究同樣表明有機酸的抑菌活性不僅取決于pH值，還與未解離的有機酸分子特性有關。

圖2 苯乳酸、醋酸對單核細胞增生李斯特菌Zeta電位的影響Fig.2 Effect of PLA and ACE on Zeta potential of L.monocytogenes

2.3 苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌膜電位的影響

熒光探針DiSC3(5)能進入正常細胞并自我猝滅，但如果細胞在抑菌物質作用下發生去極化后，DiSC3(5)就會從細胞中釋放出來，導致熒光強度的增加。由圖3可知，空白組和尼日利亞菌素處理的陰性對照組熒光強度幾乎一致。而用纈氨霉素處理的陽性對照組熒光強度明顯增加至936.4，1/4 MIC苯乳酸、MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸、MIC醋酸及1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯用組處理后，熒光強度分別為817.1、1 643、885.4、1 588、1 458。表明苯乳酸和醋酸對單核細胞增生李斯特菌的跨膜電勢的消散程度隨著抑菌劑濃度的增加而增加，其中MIC苯乳酸和MIC醋酸組對膜電勢的消散作用極強，因為其熒光強度（1 643、1 588）遠大于陽性對照組（936.4），且MIC苯乳酸對膜電勢的消散作用強于MIC醋酸組。此外，1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯用組和1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸組相比，熒光強度明顯增加，幾乎達到MIC醋酸組處理后的熒光強度，破壞程度明顯增大。表明苯乳酸、醋酸及其聯用組能消散膜電勢，且1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯用組對膜電勢的消散具有協同性。

圖3 苯乳酸、醋酸對單核細胞增生李斯特菌膜電位的影響Fig.3 Effect of PLA and ACE on membrane potential of L.monocytogenes

2.4 苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌細胞膜完整性的影響

采用SYTO9和PI兩種熒光染料對細胞染色觀察苯乳酸與醋酸對細胞膜完整性的影響[27]。SYTO9能將所有細胞染色并發出綠色熒光，PI只能穿透細胞膜受損的細胞與核酸結合發出紅色熒光，因此可以用來觀察受損傷的細胞。從圖4可以看到，未經處理的單核細胞增生李斯特菌發出綠色熒光（圖4A），表明細胞膜完整。經過1/4 MIC苯乳酸處理后，細胞發出黃綠色熒光（圖4B），經過1/2 MIC醋酸處理后的大部分菌體發出黃色熒光（圖4D），表明細胞膜受到損壞，而經過MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸處理后的菌體發出橙色或者橙紅色（圖4C、E、F），表明細胞膜受到嚴重破壞。

為了明確苯乳酸和醋酸對細胞膜完整性的破壞程度，進一步采用流式細胞術定量考察細胞膜完整性的破壞程度。從圖5可以看出，空白組僅有3.4%的細菌膜遭到破壞，經過MIC的苯乳酸、醋酸處理后，細胞膜破損率分別為97.1%，97.2%，可以看出兩種抑菌劑對細胞膜完整性的破壞作用很強，且隨著質量濃度的增加而增大。此外，經過1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理后，細胞膜破壞率分別為77.7%和91.4%，而1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對細胞膜完整性的完全破壞率為98.4%，顯示出較好的抑菌活性。該結果與上述熒光顯微鏡的結果一致，均表明苯乳酸和醋酸對細胞膜完整性具有破壞性，且MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對細胞膜完整性破壞比較嚴重，同時1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對細胞膜還顯示出協同破壞性。Liu Fang等[28]發現1%的苯乳酸即可破壞大腸桿菌細胞膜的完整性。

圖4 熒光顯微鏡分析苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌細胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of combination of PLA and ACE on cell membrane integrity of L.monocytogenes evaluated by fluorescence microscopy

圖5 流式細胞術分析苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌細胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of combination of PLA and ACE on cell membrane integrity of L.monocytogenes evaluated by flow cytometry

2.5 苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌形態結構的影響

圖6 苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌微觀結構的影響Fig.6 Effect of combination of PLA and ACE on cell microstructure of L.monocytogenes evaluated by scanning electron microscope

采用掃描電子顯微鏡考察了苯乳酸和醋酸對單核細胞增生李斯特菌形態的影響，從圖6可以看出，未經處理的單核細胞增生李斯特菌表面圓潤光滑、形態完好（圖6A）。經1/4 MIC苯乳酸處理后菌體出現抱團、表面皺縮（圖6B）；經MIC苯乳酸處理后，菌體出現黏連、內容物泄出（圖6C）。經1/2 MIC醋酸處理后，菌體表面出現皺縮，發生輕微的黏連現象（圖6D）；經MIC醋酸處理后，菌體出現黏連、內容物泄出、細胞形態結構變化（圖6E）。經1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸處理后，菌體表面變得粗糙，發生黏連且內容物泄出（圖6F）。上述結果表明，隨著苯乳酸和醋酸質量濃度的增加，對單核細胞增生李斯特菌的破壞作用增大，1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對細胞的破壞程度顯著高于單獨使用1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸，能達到MIC苯乳酸、MIC醋酸對細胞的破壞程度，顯示出1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸對細胞形態結構的協同破壞性。結合圖3和圖4推斷苯乳酸、醋酸破壞細胞膜膜電勢后，造成細胞膜通透性增加，完整性遭到破壞，進而影響細胞功能和形態，導致菌體死亡。有機酸可對細胞膜結構產生影響，如Wang Chenjie等[29]用透射電子顯微鏡觀察乳酸對單細胞增生李斯特菌超微結構的變化，結果顯示乳酸使細胞膜發生凹陷、質壁分離、細胞質密度降低等現象，從而使細胞失活。Dieuleveux等[10]報道，苯乳酸處理單核細胞增生李斯特菌后，通過掃描電子顯微鏡觀察到菌體細胞壁失去剛性，細胞發生膨脹，最后完全崩解。

2.6 苯乳酸與醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌基因組DNA的影響

圖7 苯乳酸與醋酸聯用后單核細胞增生李斯特菌基因組DNA的凝膠電泳圖Fig.7 Gel electrophoresis images showing the effect of combination of PLA and ACE on genomic DNA of L.monocytogenes

采用瓊脂糖凝膠電泳法考察了苯乳酸和醋酸對單核細胞增生李斯特菌基因組DNA的影響。游離的核酸凝膠染料4S Red Plus的熒光微弱，當其與DNA結合后，會發出強烈的熒光。從圖7可以看出，與對照組比較，1/4 MIC苯乳酸及1/2 MIC醋酸處理的DNA條帶亮度發生不同程度的減弱，可能是1/4 MIC苯乳酸和1/2 MIC醋酸破壞了DNA。此外，1/2 MIC醋酸還出現了DNA滯留在進樣口的情況，表明1/2 MIC醋酸與DNA發生電中性而部分停留在上樣孔。而MIC苯乳酸、MIC醋酸及1/4 MIC苯乳酸＋1/2 MIC醋酸聯用組均出現條帶消失，表明它們對DNA的作用比單一的1/4 MIC苯乳酸或1/2 MIC醋酸強，可能將DNA降解成小碎片。上述凝膠電泳結果表明苯乳酸和醋酸可通過降解DNA，從而影響DNA復制、轉錄等一系列過程，達到抑菌目的。本研究結果與乳酸鏈球菌素等細菌素對菌體DNA的作用方式類似，均可以導致DNA降解從而發揮抑菌活性[30]；此外，1/2 MIC醋酸與殼聚糖對菌體DNA的影響類似，均出現DNA滯留在進樣口，且條帶亮度減弱的現象，推測1/2 MIC醋酸可以通過與DNA結合，改變DNA電荷特性而發揮抑菌活性[31]。

3 結 論

苯乳酸和醋酸聯用對單核細胞增生李斯特菌具有協同抑菌性，抑菌位點包括細胞膜、DNA。苯乳酸和醋酸聯用通過影響細胞表面電荷、破壞細胞膜（包括細胞膜電勢及細胞膜完整性）引起細菌形態結構的改變，進入細胞后與DNA發生相互作用，從而擾亂細胞內正常的生理代謝活動，使細胞死亡發揮抑菌作用。苯乳酸和醋酸聯用對菌體各抑菌靶位的破壞作用顯著高于各抑菌劑單獨作用的破壞程度。本研究表明苯乳酸與醋酸復配能降低苯乳酸的使用量，為苯乳酸在食品防腐中的應用提供了科學依據。