膠原蛋白/纖維素納米晶體敷料的制備及性能

周姝妤， 許淑琴,2， 梁李園， 陳敬華,2

（江南大學 1. 藥學院；2. 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

外科手術、慢性潰瘍或燒傷后形成的傷口使皮膚的屏障作用遭到嚴重破壞，伴隨而來的傷口感染和炎癥反應將引發劇烈疼痛，影響傷口愈合，甚至有可能危及患者生命。理想的傷口敷料應具有屏障作用：抵抗外源性微生物入侵、保持環境濕潤以及促進傷口愈合[1-3]。

膠原蛋白（Col）已被廣泛應用于傷口敷料領域。膠原基敷料具有優異的生物相容性、良好的生物降解性和弱抗原性，但其較差的力學強度、熱穩定性和快速生物降解性仍限制著它的應用[4-6]。Shinya 等[4]通過冷凍干燥透明質酸、表皮生長因子和膠原混合溶液的方式制備海綿狀敷料，通過紫外光交聯法提高海綿的力學強度，該敷料有促進血管生成和肉芽組織形成的作用，有利于傷口愈合。Ge 等[5]通過將膠原海綿直接浸入二醛化黃原膠（DXG）-銀納米顆粒（AgNP）水溶液的方式制備了一種抗菌海綿敷料，DXG 有效提高了AgNP 在水中的分散性，并與膠原發生化學交聯，賦予了敷料形狀記憶的新特性。然而，如何進一步提高膠原基敷料的力學強度并賦予它額外的特性如抗菌性、抗炎性和鎮痛效果仍是目前的研究熱點。

天然纖維素是自然界最豐富的生物質之一，用酸水解其無序晶間區域可以獲得纖維素納米晶須（CNCs）。CNCs 具有高縱橫比、高強度、高生物豐度以及良好的表面可修飾性等特點。自1995 年Favier 等[7-9]發表以CNCs 作為增強材料制備復合膜的研究后，CNCs 及其衍生物在該領域引起了極大關注。Huang 等[10]制備了一種由羧甲基殼聚糖和改性CNCs 制備的自愈合納米水凝膠，CNCs 的大比表面積和縱橫比為水凝膠提供了大量活性交聯位點，改善了水凝膠的強度，還使其具有快速自愈能力。Shao 等[11]也報告了一種高彈性且可快速自愈合的納米復合水凝膠，以馬來酰亞胺化聚乙二醇包裹呋喃基修飾的CNCs，構建了一種互穿網絡結構。

布洛芬（IBP）作為一種已被廣泛使用的非甾體抗炎藥（NSAID），具有解熱鎮痛和抗炎作用。已有研究證明口服IBP 對骨關節、靜脈性腿部潰瘍和肌肉愈合具有良好的抗炎效果，但該過程會產生明顯的副作用，如胃腸道損傷和腎功能衰竭的風險[3,12,13]。

本文綜合了CNCs 的表面可修飾性和增強功能、Col 的生物相容性和保濕性以及IBP 的抗炎鎮痛功能，將醛基引入CNCs 表面獲得雙醛化纖維素納米晶須（DACs），利用抽濾制膜的方法，使DACs 表面的醛基和Col 的氨基發生希夫堿反應，最終得到了一種透明且兼具良好力學性能和生物相容性的Col/DACs-IBP 多層膜，通過緩釋IBP 達到抗炎鎮痛的效果，可應用于敷料領域。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

纖維素：湖北化纖集團有限公司；Col：無錫貝迪生物工程有限公司；小鼠胚胎成纖維細胞株（NIH-3T3）：中國科學院上海細胞庫；DMEM 培養基：Gibco 公司；噻唑藍（MTT）：Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（FBS）：杭州四季青公司；其他化學試劑：分析純，國藥集團（上海）化學試劑有限公司。

1.2 CNCs 與DACs 的制備

CNCs 的制備方法在參考文獻[14]的基礎上進行了一定的改進，取15 g 纖維素浸沒在200 mL w=30%的硫酸中，在60 ℃下劇烈攪拌8 h。以冷水稀釋反應液，離心洗滌沉淀至中性，超聲后再次離心，所得上清液即CNCs 水溶液（w=1.8%）。

參考文獻[15, 16]在避光條件下取2.6 g 高碘酸鈉溶解于200 mL CNCs 水溶液（w=1.0%）中，調節體系pH 至3.0，反應一定時間后用乙二醇終止反應，將所得產物在去離子水中透析3 d。通過控制反應條件（見表1），得到4 種氧化度不同的DACs。

1.3 C/D 膜的制備

取Col 溶解于 0.01 mol/L 的乙酸溶液中，得到Col 溶液（w=0.1%）。取適量IBP 溶解于0.1 mol/L 的NaOH溶液中，制備IBP 溶液（w=0.4%）。將IBP 溶液與CNCs 溶液（w=0.4%）混合，得到CNCs-IBP 混合溶液。通過交替抽濾Col 溶液和CNCs-IBP 混合溶液，制備Col/CNCs-IBP 多層膜。將復合膜剝離濾膜，在室溫下晾干，命名為C/C-m 膜，m 表示膜層數。將CNCs 溶液替換為DACs溶液，重復以上步驟，制備Col/DACs-IBP 多層膜，命名為C/Dn-m 膜，Dn 即D1～D4，m 表示膜層數。

1.4 測試與表征

1.4.1 CNCs 與DACs 的結構 原子力顯微鏡（AFM，德國布魯克公司Dimension ICON 型）：將5 μL 樣品（w=0.01%）滴至云母片表面，晾干后觀察；X 射線衍射儀（XRD，德國布魯克公司D8 型）：將樣品凍干后進行測試，測試范圍為5°～50°；Zeta 電位及納米粒度分析儀（英國馬爾文公司，Zetasizer nano ZS 型）：將樣品稀釋至w=0.2%，用0.01 mol/L 的鹽酸調節pH 為6.0 后進行測定[17]；傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，德國布魯克公司TENSOR II 型）：將樣品凍干，通過衰減全反射法（ATR）進行紅外分析，掃描范圍為500～4 000 cm-1，掃描次數為32 次，分辨率為4 cm-1。

DACs 氧化度（DO）的測定基于醛基與鹽酸羥胺的希夫堿反應。取0.1 g DACs 于50 mL 鹽酸羥胺的乙酸緩沖液（0.2 mol/L，pH=4.5）中反應24 h，使用0.1 mol/L 標準NaOH 溶液滴定，以CNCs 作為對照[18]。DO按照式（1）計算：

表 1 DACs 的氧化反應條件以及對應的氧化度Table 1 Experimental conditions of DACs oxidation reaction and the corresponding degree of oxidation

其中：c0是標準NaOH 溶液的濃度（mol/L），V 是標準NaOH 溶液的體積（L），m 是樣品的質量（g），M 是纖維素的重復單元葡萄糖環的相對分子量質量。

1.4.2 C/D 膜的持水性 取樣品濕膜，準確稱重（ms），放入60 ℃烘箱中干燥至恒重，再準確稱重（md）。各樣品的持水率（Wc）按照式（2）計算[19]：

1.4.3 C/D 膜的透光度 采用紫外-可見分光光度計（日本島津公司UV-2550 型）測量樣品在300～800 nm 處的透光率[20]。

1.4.4 C/D 膜的拉伸強度 采用中國美特斯工業系統公司CMT8202 型萬能實驗機測試。將樣品裁剪為6.0 cm ×1.0 cm 的長條，在室溫下測試樣品的拉伸強度，拉伸速率為0.5 mm/min。

1.4.5 C/D 膜的內部微觀結構 將樣品于液氮中浸泡并脆斷，經凍干、固定和噴金處理后，在加速電壓5 kV 下采用掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司Hitachi Su 1510 型）觀察其內部微觀結構。

1.4.6 IBP 的體外釋放 參照文獻[12, 13]，將樣品浸泡于10 mL PBS 溶液（pH=7.4）中，于37 ℃，110 r/min 環境中振蕩，在一定的時間間隔取樣，并立即補充等體積的PBS 溶液。使用紫外-可見分光光度計測定釋放液于264 nm處的吸光度，并按照式（3）計算其在不同時刻的藥物累計釋放率（R）。

其中：Ve為取出的釋放液體積（mL）；V0為加入釋放液的總體積（mL）；m 為樣品中IBP 的質量（mg）；ci、cn分別為i 時間點及第n 個時間點所取釋放液中的IBP 質量濃度（mg/mL）。

1.4.7 C/D-IBP 膜的生物相容性 通過與NIH-3T3 細胞的共培養評價C/D-IBP 膜的生物相容性。細胞在DMEM培養基中培養（體積分數為10 %的胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素），培養環境為37 ℃，體積分數為5% 的CO2。將預先滅菌的復合膜放入48 孔板，經PBS 溶液清洗和DMEM 培養基浸潤后接種細胞，于第1 天和第3 天分別以MTT 法評價細胞增殖情況，利用酶標儀（美國伯樂公司680 型）測定570 nm 處的氧化度。

2 結果與討論

2.1 CNCs 與DACs 的特性以及結構表征

2.1.1 外觀形貌 在水解反應中硫酸的作用下，CNCs 和DACs 表面均呈現了大量羥基和磺酸酯基，這些負電荷基團之間產生強烈靜電排斥作用，使其能穩定均勻地分布在水中[8,17]，如圖1 所示。圖2 顯示了CNCs 與不同氧化度DACs 溶液Zeta 電位的變化。CNCs 與D1～D4 溶液的Zeta 電位均為負值，隨著DACs 氧化度的提高，DACs 溶液的Zeta 電位從-17 mV 逐漸提高至-10 mV，即仍有大量負電荷被保留在DACs 表面，因此DACs 溶液可通過靜電相互作用保持良好的穩定性。CNCs 和D3 的AFM 圖（圖3）顯示，CNCs 和DACs 均呈棒狀。CNCs 長為（224 ± 64）nm，高為（9 ± 3）nm（統計數N=80），均勻分散。D3 長為（208 ± 30）nm，寬為（9 ± 3）nm（N=80），略小于前者，輕微聚集。圖4 顯示了CNCs 與不同氧化度DACs 的XRD 結果，CNCs 與DACs 均在14.9°、16.5°和22.7°處出峰，與文獻中的結果一致[6,21]，但峰形隨著氧化度的提高而明顯減小。這說明氧化反應可使DACs 尺寸變小，分布穩定性降低，并會對其晶體結構產生一定的破壞，但通過控制反應條件，D1～D4 依然維持了基本的結晶形態和良好的分散穩定性。

圖 1 CNCs 和D1～D4 水溶液的照片Fig. 1 Photos of CNCs and D1—D4 dispersions

圖 2 CNCs 和D1～D4 水溶液的Zeta 電位Fig. 2 Zeta potential of CNCs and D1—D4 dispersions

圖 3 CNCs 和D3 的AFM 圖Fig. 3 AFM micrographs of CNCs and D3

2.1.2 氧化度 如圖5（a）所示，FT-IR 譜圖中CNCs 在3 400 cm-1處的寬峰歸屬于O―H 伸縮振動，2 900 cm-1處的吸收峰歸屬于C―H 伸縮振動，1 050 cm-1和1 160 cm-1處的吸收峰與C―O 的伸縮振動有關。在DACs（D1～D4）的譜圖中，1 730 cm-1和889 cm-1處出現了新的吸收峰，這分別歸因于醛基和半縮醛的形成，表明CNCs 發生了氧化[9,18,22]。

2.2 C/D 膜的特性以及結構表征

2.2.1 內部微觀結構 圖5（b）顯示了Col、D4 與C/D4-6

圖 4 CNCs 和D1～D4 的XRD 譜圖Fig. 4 XRD spectra of CNCs and D1—D4

膜的FT-IR 譜圖。C/D4-6 膜在1 730 cm-1處的醛基峰明顯減弱，而1 549 cm-1處出現了―C＝N―的特征峰，這表明DACs 表面的醛基與Col 表面的氨基發生了希夫堿反應，醛基被消耗，而希夫堿鍵形成[6]。此外，圖6 顯示了C/C-6 膜和C/D3-6 膜的多層結構以及層間界面結構。圖6（b，d）的上側為Col 層，其結構緊密連續且可見層次結構；圖6（b，d）的下側分別為CNCs 層和DACs 層，其結構相對松散，存在較小孔隙且未見分層。此外，C/C-6 膜的Col 層和CNCs 層界面處存在孔隙，而C/D3-6 膜層間結合緊密，互相滲透。這表明Col 層和DACs 層發生的希夫堿反應加強了兩者的結合。

圖 5 CNCs 和D1～D4 的FT-IR 譜圖 （a） 以及Col 和C/D 膜的FT-IR 譜圖（b）Fig. 5 FT-IR spectra of CNCs and D1—D4 （a）, Col and the C/D films （b）

圖 6 C/C-6 膜和C/D3-6 膜的SEM 圖Fig. 6 SEM images of C/C-6 film and C/D3-6 film

2.2.2 持水性 傷口表面過度干燥將引起皮膚的皺縮，因此，具有良好保濕性的敷料更有利于傷口的修復。本文通過固定Col 和DACs 的質量，改變復合膜的層數和每層質量，探究兩者分布均勻性以及DACs 氧化度對其持水性的影響。復合膜層數越多，DACs 與Col 接觸面積越大，兩者分布越均勻。如圖7（a）所示，隨著DACs 氧化度的提高，C/Dn-6 膜的持水率逐漸下降，C/D3-6 膜持水率為78.4%，比C/C-6 膜降低了13.3%。這表明隨著氧化度的提高，DACs 的粒徑稍有下降，DACs 層內孔隙率下降。此外，DACs 表面更高的醛基密度提高了層間結合的緊密度，對Col 層起到壓縮和固定作用，限制了Col 的持水能力，進一步降低了復合膜的持水性。但圖7（b）顯示了DACs 層對Col 層的這種壓縮和固定作用是相對有限的，由于Col 在復合膜中起主要的持水作用，當改變D3 與Col 的分布均勻性時，層數對C/D3 膜持水性的影響并不明顯。

圖 7 DACs 氧化度（a）和層數（b）對C/D 膜持水性的影響Fig. 7 Effect of degree of oxidation of DACs （a） and the number of layers （b） on the water content of C/D films

2.2.3 透光性 提高敷料的透光性便于實時監測傷口情況。本文探究了DACs 的氧化度以及DACs 和Col 的分布均勻性對復合膜透光率的影響。表2 顯示隨著DACs 氧化度和層數的增加，復合膜透光性逐漸提高，C/D4-6 的透光率高達95.7%，相比C/D3-2 提高了13.5%。提高DACs 氧化度以及DACs 和Col 的分布均勻性增強了兩種基質的結合程度，促進了復合膜內部結構均一化，從而提高了透明度。

2.2.4 拉伸強度 圖8 為DACs 氧化度和層數對C/D 膜拉伸強度的影響。由圖8 可知，C/D3-4 膜拉伸強度可達54.2 MPa，分別是C/D1-4 膜和C/D3-2 膜的2.2 倍和2.5 倍，表明提高DACs 和Col 的分布均勻性以及DACs 氧化度均可提高C/D 膜的拉伸強度。當層數從2 增加至4 時，C/D3 膜的強度顯著增強，斷裂伸長率也有稍有增加。

表 2 DACs 氧化度和層數對C/D 膜透光率的影響Table 2 Effects of degree of oxidation of DACs and the number of layers on the light transmittance of C/D films

圖 8 DACs 氧化度（a）和層數（b）對C/D 膜拉伸強度的影響Fig. 8 Effect of degree of oxidation of DACs （a） and the number of layers （b） on the tensile strength of C/D films

2.2.5 藥物釋放行為 圖9 顯示了IBP 溶液與CNCs 溶液或DACs 溶液混合前后的粒徑分布情況，純CNCs溶液有兩個峰（58、330 nm），D4 溶液也有兩個相似的峰（38、267 nm）。而IBP 與CNCs 或D4 的混合溶液的兩個峰均向大尺寸方向偏移，其中，D4-IBP 水溶液的兩個峰分別位于56 nm 和390 nm 處，表明IBP 與D4 可能通過非共價鍵力（氫鍵）作用發生聚集，導致粒徑變大。而無微米級顆粒則表明混合溶液具有良好的穩定性。溶液中的粒子略有聚集，但CNCs 和DACs 仍維持了良好的分散性，可以認為IBP 的加入對DACs 的穩定性無較大影響。

圖 9 樣品的粒徑分布情況Fig. 9 Particle size distribution of samples

在體外藥物釋放測試中，C/D 膜中的IBP 都在24 h 內達到釋放穩定，但24 h 藥物累計釋放率存在明顯差異（43.8%～91.6%），如圖10 所示。大部分IBP 分布在DACs 層內，被上下兩層Col 包裹，形成“三明治結構”。由于Col 層結構緊密，IBP 只能通過擴散的方式，緩慢地穿過Col 層到達傷口表面。因內層DACs 中的IBP 需要更長時間的滲透才能釋放，DACs 與Col 多層分布的設計延長了IBP 的釋放時間，可達到緩釋效果。當DACs 氧化度較低時，隨著氧化度的提高，復合膜的結合程度提高，內部孔徑縮小，24 h 藥物累積釋放率逐漸降低。但當DACs 氧化度高于30%時（D3，D4），24 h 藥物累積釋放率明顯提高，這是由于復合膜結合程度過高，孔隙率大大減小，載藥量大幅下降，導致釋放率明顯提高。可見，適當降低DACs 氧化度更有利于IBP 的負載和釋放。

2.2.6 生物相容性 如圖11 所示，當細胞與C/D 膜共培養24 h 時，其增殖情況均優于對照組，可見該復合膜有利于細胞的吸附、生長和增殖，但該效應隨著DACs 氧化度的提高而減弱。當共培養至72 h 時，只有DACs 氧化度低于36.7%的復合膜（D1，D2）能促進細胞的增殖，這是由于復合膜外層的Col 被逐漸降解，大量DACs 被暴露出來，與細胞表面接觸，對細胞的增殖產生抑制作用。可見，C/D 膜表現出良好的生物相容性，在短期傷口覆蓋過程中有利于傷口修復。

圖 10 DACs 氧化度對C/D 膜中IBP 釋放行為的影響Fig. 10 Eeffect of degree of oxidation of DACs on the IBP release from C/D films

圖 11 DACs 氧化度對C/D 膜生物相容性的影響Fig. 11 Eeffect of degree of oxidation of DACs on the biocompatibility of C/D

3 結 論

（1）采用酸水解法和高碘酸鈉氧化法制得氧化度為8.6%～51.3%的DACs，產物呈棒狀，長為（208 ± 30 ）nm，寬為（9 ± 3） nm，可在水中穩定分散。

（2）通過交替抽濾DACs-IBP 混合溶液和Col 溶液制備C/D 多層膜。相鄰DACs 層的醛基和Col 層的氨基在界面處發生希夫堿反應，形成化學交聯網絡。

（3）增加C/D 膜的層數有利于DACs 和Col 的分布趨于均勻化，而提高DACs 的氧化度增強了兩者間的化學交聯，使膜的微觀結構更加均一緊密。與CNCs 相比，D3 使復合膜透光率從86.9%提高到94.3%，持水率從90.4%降至78.4%。最優C/D 膜的拉伸強度高達54.2 MPa。

（4）C/D 膜具有良好的生物相容性，用于短期傷口覆蓋可有效促進細胞黏附和生長，有利于傷口修復。

（5）C/D 膜負載的IBP 藥物在24 h 內緩慢釋放，累計釋放率可達89.0%，賦予了該膜抗炎鎮痛的功效。