流產衣原體TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

溫 淵，劉東慧，李兆才，譚書敏，梁 林，黃 勇，周繼章*

(1. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046；2. 西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100)

衣原體(Chlamydia)是一類專性胞內寄生的革蘭氏陰性菌，具有復雜的形態結構，依賴宿主的能量合成自身的代謝物質，是一種重要的人畜共患病原體[1]。衣原體科下只有一個衣原體屬，共有14個衣原體種[2]，其中的流產衣原體(Chlamydiaabortus,C.abortus)是導致綿羊衣原體病的主要原因。綿羊衣原體病是一種重要的人畜共患病，又稱綿羊地方性流產(Enzootic abortion of ewes, EAE)[3]。母羊感染流產衣原體后會導致化膿性胎盤炎、早產、產出死胎或虛弱的羊羔，并且母羊成為病原體攜帶者，在孕期通過胎盤、流產胎兒或陰道分泌物排出大量病原體，感染其他動物或人類[4-5]。此外，孕婦可能在接觸感染動物后患病，導致流產[6]。流產衣原體的主要宿主是家畜，但在全球各地的其他物種中也發現了零星病例，如馬和鹿等[7-8]，甚至野鴨中也有發現，感染宿主極其廣泛，其引起的大規模流產給全球大多數地區造成了不容忽視的經濟損失[7]。

目前我國對流產衣原體大規模診斷的方法主要有IHA技術和常規PCR技術，但IHA技術操作繁瑣且靈敏度較低，常規PCR只能進行定性檢測。實時熒光定量PCR方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好及操作簡便等特點，在分子生物學診斷方面有廣泛應用。國內針對流產衣原體實時熒光定量PCR方法的研究相對較少，張志君和周丹娜等分別建立了針對流產衣原體的SYBR Green Ⅰ方法和分子信標探針方法[9-10]，但這些方法尚未在臨床檢測和動物衣原體病的流行病學研究中大規模應用。TaqMan探針法比SYBR Green Ⅰ方法具有更強特異性和靈敏度，與分子信標探針法比較具有操作簡便、成功率高等優點。因此，本研究以衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protein-like activity factor, CPAF)的基因組序列為靶基因設計針對流產衣原體的引物及TaqMan探針，旨在建立一種快速、特異的TaqMan實時熒光定量PCR方法，為流產衣原體的早期診斷提供可靠方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及基因組 流產衣原體GN6菌株、沙眼衣原體基因組、大腸桿菌基因組、沙門氏菌基因組均在中國農業科學院蘭州獸醫研究所畜禽重要人獸共患病團隊細菌病組保存。布魯氏菌基因組由中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物細菌病團隊提供。剛地弓形蟲基因組由中國農業科學院蘭州獸醫研究所畜禽重要人獸共患病團隊寄生蟲組提供。

1.2 主要試劑 2×Premix Ex TaqTM、pMD19-T載體、感受態細胞DH5α購自大連寶生物工程有限公司。質粒小提試劑盒、小提膠回收試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司。DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。QuantiNova Probe PCR Kit購自深圳凱杰生物工程有限公司。

1.3 引物探針的設計 比對了GenBank中不同衣原體種CPAF的編碼基因序列，包括ChlamydiaabortusLLG(GenBank NZ_CP018296.1)、Chlamydiamuridarumstr.Nigg(GenBank NC_002620.2)、Chlamydiapsittaci6BC(GenBank NC_017287.1)、ChlamydiapneumoniaeTW-183(GenBank NC_005043.1)、ChlamydiapecorumPV3056/3(GenBank NC_022439.1)、Chlamydiasuis(GenBank NZ_LS398098.1)，設計多對針對流產衣原體CPAF的基因引物及TaqMan探針。

1.4 引物探針的篩選 以布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、弓形蟲及沙眼衣原體的基因組作為模板，以流產衣原體基因組為陽性對照，ddH2O為空白對照進行實時熒光定量PCR試驗，對初步設計的多對引物探針進行特異性篩選。

1.5 DNA的提取 本試驗菌株DNA的提取參考北京天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒步驟操作。

1.6 標準質粒的構建 以篩選出的引物作為擴增引物，以流產衣原體GN6菌株的DNA作為模板進行PCR擴增，產物膠回收后克隆到pMD19-T載體中。將重組質粒轉化DH5α感受態細胞，涂布于LB Amp平板上，37 ℃過夜培養，挑取單克隆，LB培養基增菌培養后進行菌液PCR鑒定并送至西安擎科生物科技有限公司測序，提取陽性菌液的質粒。利用分光光度計測定陽性重組質粒pMD19T-CPAF的濃度并換算拷貝數。

1.7 實時熒光定量PCR方法的優化 采用矩陣法對引物濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L)、探針濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 μmol/L)和退火溫度(55 ℃～65 ℃)分別進行實時熒光定量PCR反應，最終篩選出最佳引物探針濃度及退火溫度。

1.8 標準曲線的建立 以10倍倍比稀釋后的重組質粒pMD19T-CPAF為模板進行實時熒光定量PCR反應，構建該方法的標準曲線。

1.9 特異性試驗 以布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、弓形蟲、沙眼衣原體基因組為模板，流產衣原體的基因組為陽性對照，設立空白對照進行試驗。

1.10 靈敏度試驗 以稀釋后的重組質粒為模板，設立空白對照，分別進行普通PCR和實時熒光定量PCR試驗，得到兩種方法可以檢出重組質粒的最低拷貝數。

1.11 重復性試驗 以濃度為2.6×107～2.6×104copies/μL的重組質粒作為模板，作3個平行對照，進行組內重復試驗，再重復3次組內重復試驗，進行組間重復試驗，計算不同梯度的Ct平均值、標準差及變異系數(%)，評估組內及組間差異。

1.12 臨床樣本檢測 從甘肅省某流產綿羊飼養場采集生殖道拭子共156份。為了鑒定導致該羊場流產的病原體，分別對采集的樣本進行流產衣原體、布魯氏菌、貝納柯克斯體(Coxiellaburneti)、Waddliachondrophila、李斯特氏菌(Listeriamono￣cytogenes)及弓形蟲進行實時熒光定量PCR檢測。合成Waddliachondrophila、李斯特氏菌[11]及貝納柯克斯體[12]的特異性引物及探針，弓形蟲、布魯氏菌引物及探針由本實驗室保存。使用本研究建立的方法和OIE參考推薦的方法分別檢測該批臨床樣本，通過統計流產衣原體的檢出率，比較兩種方法的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 引物探針的設計 設計了8對針對流產衣原體CPAF基因的特異性引物及探針(表1)。

2.2 引物探針的篩選 篩選結果顯示，只有Cab-CPAF8引物探針與其它病原物無交叉反應，證明其特異性良好(表2)。

2.3 重組質粒pMD19T-CPAF的鑒定 重組質粒pMD19T-CPAF經過PCR擴增后使用瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察結果并拍照。pMD19T-CPAF片段大小約為113 bp(圖1)，與預期結果相同，菌液送西安擎科生物科技有限公司測序，結果顯示目的基因成功插入重組質粒。大量提取陽性質粒，在紫外分光光度計下測定其濃度為79 ng/μL，拷貝數為2.6×1010copies/μL。

表1 Cab-CPAF1～Cab-CPAF8引物探針序列Tab 1 Sequences of Cab-CPAF1～Cab-CPAF8 primers and probes

表2 Cab-CPAF8引物和探針的序列Tab 2 Sequence of Cab-CPAF8 primers and probe

M：DL2000 Marker；1：pMD19T-CPAF擴增產物；2：陰性對照M: DL2000 Marker; 1: Amplification of pMD19T-CPAF; 2: Negative control圖1 重組質粒pMD19T-CPAF PCR擴增結果Fig 1 The result of pMD19T-CPAF by PCR

2.4 實時熒光定量PCR方法的建立及優化 經過優化，最終確定反應體系：2×Premix Ex Taq 10 μL，Cab-F 0.5 μL，Cab-R 0.5 μL，Cab-P 0.5 μL，DNA 2 μL，ddH2O補齊至20 μL。反應條件：95 ℃預變性；95 ℃變性 10 s，57 ℃退火 10 s，44個循環。

2.5 標準曲線的構建 當重組質粒濃度在2.6×107～2.6×102copies/μL時，其標準品拷貝數的對數值(x)與Cq值(y)存在良好的線性關系，線性方程y=-3.209x+40.773，R2=0.995，擴增效率E=105%(圖2)。

2.6 特異性試驗 結果顯示，除流產衣原體的基因組DNA有特異性擴增外，其他菌株基因組DNA均未檢測到(圖3)，表明該方法特異性良好。

2.7 靈敏度試驗 普通PCR可檢出重組質粒最低濃度為2.6×102copies/μL(圖4)，實時熒光定量PCR可檢出最低濃度為2.6×101copies/μL(圖5)，靈敏度是普通PCR的10倍。

2.8 重復性試驗 組內變異系數為0.199%、0.445%、0.634%和0.969%，組間變異系數為1.45%、1.8%、2.33%和2.62%，均小于3%，證明本方法具有良好的重復性(表3和圖6)。

2.9 臨床樣本檢測 表4結果顯示，該羊場大部分綿羊流產是由于流產衣原體和貝納柯克斯體混合感染導致；通過本次156份臨床樣本檢測比較了本研究建立方法和OIE參考推薦方法的靈敏度，兩種方法檢出的流產衣原體總陽性率分別為78.21%和73.72%，表明本研究建立的方法靈敏度更高。

圖2 流產衣原體實時熒光定量PCR標準曲線Fig 2 Standard curve of real-time fluorescence quantitative PCR for C.abortus

1：陽性對照；2～6：布魯氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、沙眼衣原體、弓形蟲；7：陰性對照1: Positive control; 2～6: Brucella, Escherichia coli, salmonella, Chlamydia trachomatis,Toxoplasma gondii; 7: Negative control圖3 特異性試驗結果Fig 3 The result of the specificity assay

M：DL2000 Marker；1～8：濃度為2.6×108～2.6×101 copies/μL的陽性重組質粒；9：陰性對照M: DL2000 Marker; 1～8: The positive recombinant plasmid at 2.6×108～2.6×101 copies/μL;9: Negative control圖4 普通PCR靈敏度試驗結果Fig 4 Sensitivity result of PCR

1～7：2.6×107～2.6×101copies/μL陽性重組質粒1～7: The positive recombinant plasmid at 2.6×107～2.6×101 copies/μL圖5 實時熒光定量PCR靈敏度試驗結果Fig 5 Sensitivity result of real-time fluorescence quantitative PCR

1:第一次試驗；2：第二次實驗；3：第三次實驗1: First test; 2: Second test; 3: Third test圖6 重復性試驗結果Fig 6 The result of the repeated test

表3 實時熒光定量PCR組內和組間重復性試驗結果Tab 3 Intra-group and inter-group reproducibility test results of real-time fluorescence quantitative PCR

表4 臨床樣本檢測結果Tab 4 Results of clinical sample test

3 討論與結論

隨著流產衣原體的流行范圍不斷擴大，其對畜牧業發展的危害愈發嚴重，已經引起了獸醫界的廣泛關注。近些年的研究顯示，流產衣原體可感染的宿主越來越廣泛，不僅可以感染牛、羊等陸地上的反芻動物，而且還會感染海洋中的哺乳動物，一項研究報告指出，地中海擱淺的斑紋海豚中通過PCR僅檢測到流產衣原體，可能是斑紋海豚擱淺和死亡的原因，這是首次在海洋哺乳動物中發現流產衣原體的病例[13]。受感染的動物可能會成為感染源而感染人類，導致患者全身感染或流產[14]。

目前，流產衣原體病的防控主要采用疫苗接種防治，但最近研究表明流產衣原體1B型疫苗未能對流產衣原體感染動物產生免疫保護作用，反而可能會導致動物流產[15]。流產衣原體病的防控不僅需要疫苗的開發應用，也需要早期的及時診斷，其嚴重程度也離不開流行病學的調查。我國針對流產衣原體病的檢測技術主要依靠IHA，但該方法檢測結果需要通過肉眼判定，存在人為主觀性，并且敏感性較低，同時，針對流產衣原體主要外膜蛋白的套式PCR技術雖然簡便、快速，但是特異性及靈敏度不高，易產生假陽性的結果。TaqMan實時熒光定量PCR是一種操作簡便、特異性強、靈敏度高的診斷技術，可以快速且準確定量樣本中的病原體數量，無需電泳步驟，大大提高了檢測效率。

本研究通過對某羊場流產原因的檢測分析，比較了本研究建立的方法與OIE參考推薦方法的靈敏度，結果顯示，本研究建立的方法靈敏度要高于OIE參考推薦的方法，表明了該方法不僅適用于臨床樣品的大規模檢測且具有較高的靈敏度。

綜上，本研究基于CPAF基因序列，設計了一組針對流產衣原體的特異性引物探針，通過優化該方法的反應體系和反應條件，建立了一種操作簡便且具有良好的靈敏度、特異性和重復性的流產衣原體TaqMan探針實時熒光定量PCR診斷方法。該方法具有自主知識產權，為流產衣原體病的流行病學調查提供了技術手段，為流產衣原體病的防控奠定了基礎。