豬圓環(huán)病毒3型熒光定量PCR檢測方法的建立及其在豬體中的組織分布研究

薛 霜，石寶蘭，徐 松，徐丹丹，顧素云，漆世華，李婷婷，馮 釗，謝紅玲

(國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司，武漢 430075)

豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新型的豬圓環(huán)病毒，基因組全長2.0 kb，為單鏈環(huán)狀、無囊膜的DNA病毒，形態(tài)呈正二十面體形，GC含量50%，包含3個主要開放閱讀框(opening reading frame，ORF)，與其他圓環(huán)病毒科病毒具有類似的基因組結(jié)構(gòu)，但衣殼蛋白氨基酸序列同源性很低。PCV3與PCV2的Cap蛋白同源性僅約30%，且二者在Cap蛋白抗原表位上無任何同源性，表明這2種毒株之間不具有交叉免疫保護(hù)特性。PCV3能引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)[1-2]，與PCV2引起的臨床癥狀極其相似，給臨床確診帶來一定的難度。自2016年以來，PCV3已在多個國家豬群中相繼被檢測到[3-5]。我國研究人員通過大范圍的檢測發(fā)現(xiàn)，該病原在來自我國多個省份的樣品中也有檢測到[6-7]。

本研究以臨床分離的PCV3陽性組織毒感染斷奶仔豬，并通過建立的熒光定量PCR檢測方法研究PCV3在豬不同組織臟器中的感染情況，以期為PCV3感染的診斷、預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 PCV3陽性組織毒懸液，采自湖北某豬場一PCV3陽性豬，由國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司制備并鑒定；PCV1、PCV2、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，均由國藥集團(tuán)動物保健股份有限公司鑒定和保存；大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、DNA片段回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、病毒核酸小量提取試劑盒、pMD18-T載體和Premix Ex Taq試劑盒(探針法)均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.3.1 引物及探針設(shè)計 從GenBank中下載多條具有代表性的PCV3基因全序列，利用DNAStar生物軟件分析選出基因高度保守的核苷酸區(qū)域，然后應(yīng)用Becon Design軟件設(shè)計篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針。同時設(shè)計一對擴(kuò)增PCV3 Cap蛋白基因的引物。

1.3.2 定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備 取PCV3陽性組織毒200 μL，按病毒核酸小量提取試劑盒說明書提取病毒核酸，用所設(shè)計的PCV3 Cap蛋白基因引物對提取的病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，上、下游引物終濃度均為0.5 μmol/L，Taq酶0.5 μL，模板5 μL，補(bǔ)加無菌無核酸酶水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s(35 cycles)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化，連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。隨機(jī)挑取若干單菌落接種于5 mL LB/Ampr培養(yǎng)液中，37 ℃振搖過夜，提取質(zhì)粒。按上述PCR體系和條件進(jìn)行鑒定，將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送生物公司測序。測序鑒定正確后作為PCV3熒光定量PCR陽性質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＝?jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度(連續(xù)測定3次取平均值)，計算出每微升所含的DNA拷貝數(shù)并進(jìn)行10倍梯度稀釋，取其中101～107copies/μL的陽性質(zhì)粒作為定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.3 反應(yīng)體系的建立 參考寶生物Premix Ex Taq試劑盒說明書，用所構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒為模板對熒光PCR引物、探針濃度進(jìn)行優(yōu)化后確定反應(yīng)體系。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以1.3.2中制備的定量標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用1.3.3中確定的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR檢測，得到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 熒光定量PCR檢測方法的特異性 按照1.3.3中確定的反應(yīng)體系檢測PCV1、PCV2、PCV3、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV等豬體常見病原的核酸，并設(shè)陰性水對照組，從而確定該方法的特異性。

1.3.6 熒光定量PCR檢測方法的靈敏度 將已計算出拷貝數(shù)的陽性質(zhì)粒梯度稀釋至1 copy/μL，按照1.3.3確定的反應(yīng)體系對所稀釋的不同濃度陽性質(zhì)粒進(jìn)行檢測，以此確定該方法的檢測靈敏度。

1.4 PCV3在豬體中的組織分布研究

1.4.1 動物分組 將5頭28日齡健康易感仔豬隨機(jī)分為兩組，分別為PCV3攻毒組和空白對照組，1#、2#、3#豬為攻毒組，4#、5#豬為空白對照組。

1.4.2 攻毒方法 肌肉注射PCV3陽性組織毒懸液2 mL、滴鼻8 mL，對照組按同樣方法接種無菌生理鹽水，將兩組試驗動物隔離飼養(yǎng)，逐日觀察。

1.4.3 采樣和檢測 如試驗豬攻毒后28 d內(nèi)死亡，試驗豬發(fā)現(xiàn)死亡的第一時間進(jìn)行解剖。攻毒后第28 d，剖殺其余仔豬。采集仔豬的腦、心臟、脾臟、肺臟、扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)的部分組織用于熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR檢測方法的建立

2.1.1 引物及探針設(shè)計 本方法中所使用的引物和探針序列信息見表1。

表1 PCV3熒光定量PCR引物及探針序列信息Tab 1 Fluorescent quantitative PCR primers and probe of PCV3

2.1.2 定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備 鑒定正確的陽性質(zhì)粒(圖1)經(jīng)紫外分光光度計測定核酸濃度，按公式換算成DNA拷貝數(shù)為2×1010copies/μL。1∶10倍比稀釋后取2×107～2×101copies/μL的陽性質(zhì)粒作為熒光PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品。

M：Trans2K plusⅡ DNA Marker；1：PCV3 Cap蛋白基因PCR產(chǎn)物；2：陰性對照圖1 PCV3 Cap蛋白基因PCR鑒定Fig 1 Identification of PCV3 Cap protein gene by PCR

2.1.3 反應(yīng)體系的建立 優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系為：上下游引物、熒光探針終濃度均為0.2 μmol/L，Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)加滅菌蒸餾水至總體積20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 35 s(收集熒光信號FAM)，40個循環(huán)。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 本研究建立的PCV3熒光定量PCR檢測方法在2×101～2×107copies/μL的線性范圍內(nèi)可以得到良好的動力學(xué)曲線(圖2)，且標(biāo)準(zhǔn)曲線較理想(圖3)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.257lgX+36.388(X代表核酸拷貝數(shù)，Y代表Ct值)，線性相關(guān)系數(shù)R2為1，擴(kuò)增效率為102.8%，說明本方法的檢測誤差較小，可信度較高。

A～G：2×107～2×101 copies/μL的定量標(biāo)準(zhǔn)品；H：陰性水對照圖2 PCV3熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖Fig 2 Fluorescent quantitative PCR amplification curves of PCV3 standard plasmid

圖3 PCV3熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 Fluorescent quantitative standard curve of PCV3

2.1.5 熒光定量PCR檢測方法的特異性 圖4檢測結(jié)果顯示，除PCV3外，對PCV1、PCV2及其他幾種常見豬病毒病原的檢測結(jié)果均為陰性。

2.1.6 熒光定量PCR檢測方法的靈敏度 熒光定量PCR檢測到的最小病毒核酸量為1 copy/μL，Ct值為36.94。檢測結(jié)果見圖5。

2.2 PCV3在豬體中的組織分布研究 試驗豬攻毒后28 d內(nèi)均無死亡、無明顯發(fā)病癥狀。剖殺各試驗豬，采集腦、心臟、脾臟、肺臟、扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)的部分組織用于熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，空白對照組試驗豬各組織檢測均為陰性，攻毒組試驗豬部分組織檢出PCV3陽性，病毒主要存在于肺臟、淋巴結(jié)和脾臟中，在扁桃體中有少量存在，在心臟和腦組織中均未檢測到PCV3病毒核酸(表2)。

A：PCV3擴(kuò)增曲線；B～J：PCV1、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV及陰性水對照擴(kuò)增曲線圖4 熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果Fig 4 The specific detection result of fluorescent quantitative PCR

A～G：1×106～1 copy/μL；H：陰性水對照圖5 熒光定量PCR靈敏度檢測結(jié)果Fig 5 The sensitivity detection result of fluorescent quantitative PCR

表2 PCV3在豬體主要免疫器官及部分內(nèi)臟組織的分布情況Tab 2 Distribution of PCV3 in the main immune organs and some visceral tissues of pigs

3 討論與結(jié)論

病毒分離是實驗室確診特定病原體感染的經(jīng)典方法，但由于PCV3在PK15細(xì)胞、ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞等細(xì)胞上均不產(chǎn)生細(xì)胞病變，目前仍未有研究資料報道能夠成功通過體外細(xì)胞培養(yǎng)分離到PCV3，而僅僅只是使用分子生物學(xué)檢測方法檢測到PCV3病毒核酸的存在，并進(jìn)行測序鑒定。目前對該病的研究還處于起始階段，針對PCV3的預(yù)防和控制還處于探索階段。常規(guī)PCR檢測方法簡單快速，但容易出現(xiàn)交叉污染，容易產(chǎn)生假陽性，而隱性感染和混合感染的豬群中病毒含量可能并不高。實時熒光PCR方法操作簡便、快速高效、具有較高的敏感度和特異性，而且封閉性好、不需要后續(xù)處理，大大降低了污染的可能性。顯著的優(yōu)越性使得該方法不僅在生物技術(shù)方面應(yīng)用廣泛，現(xiàn)今更作為一種診斷方法應(yīng)用于臨床。本研究結(jié)果表明所建立的熒光定量PCR檢測方法特異性好、敏感性高，可用于PCV3的快速定量檢測。

在本次研究中，雖然在PCV3人工感染豬體多種組織器官中檢測到了PCV3病毒的存在，但并未引起明顯的臨床癥狀，這可能與攻毒病毒劑量較低和該毒株毒力較弱有關(guān)。同時，檢測結(jié)果顯示1#豬的陽性組織中病毒含量較其余豬只高，而在臨床觀察中1#豬曾有鏈球菌感染情況，說明當(dāng)豬體狀態(tài)較弱或存在其他病原混合感染時可能更容易受PCV3感染。本研究人工感染PCV3豬體中，病毒主要存在于肺臟、淋巴結(jié)，在扁桃體和脾臟中有少量存在，顯示出PCV3對豬體呼吸器官和免疫器官具有較高的組織嗜性。多項調(diào)查研究提示PCV3可能與母豬繁殖障礙、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、發(fā)熱、呼吸系統(tǒng)疾病以及多系統(tǒng)炎癥相關(guān)，且還可能引起新生仔豬先天性震顫和心肌炎等[8]。因此對PCV3在豬體中的組織分布情況的研究可為進(jìn)一步揭示PCV3的感染途徑、組織嗜性和致病機(jī)理等提供理論依據(jù)。