高效液相色譜-串聯質譜法快速測定獸藥制劑中喹諾酮類、磺胺類等26種藥物

曹 秀，劉秀娟，馮慧慧，楊亞琴，余明霞，董小海，鐘紅艦

(河南省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，鄭州 450002)

目前，國內獸藥市場競爭激烈，獸藥制劑中非法添加化學藥物的現象時有發生，添加藥物種類多樣，如禁用藥物、人用藥物；添加手段隱蔽，如同類藥物代替標稱藥物，使得獸藥檢測與監管的難度越來越大[1-2]。為進一步嚴格獸藥生產與管理，農業農村部近年來連續發布了關于《獸藥中非特定非法添加物質檢查方法》的公告作為獸藥非法添加的法定標準[3-4]。獸藥非特定非法添加物質的檢查方法主要有顯微鏡檢查法[5]、薄層色譜法[6]、高效液相色譜法[7-10]、液相色譜串聯質譜法[11-14]等。顯微鏡檢查法適用性范圍窄；薄層色譜法是初篩的常見手段，但存在假陽性的風險。高效液相色譜配二極管陣列檢測法(HPLC-PDA)應用范圍廣泛，適合于不同種類獸藥制劑的非法藥物添加檢測，能準確定性和定量。該方法日益成熟，農業農村部頒布諸多公告多為該方法。然而，HPLC-PDA在獸藥非法添加物質檢查中存在局限性，如無法鑒別PDA光譜圖庫以外的化合物；部分化合物在不同色譜條件下光譜圖差異大，難溯源；無法檢測無紫外吸收的化合物，造成漏篩等[15]。液相色譜-串聯質譜法由于其高特異性、高靈敏度的優點，已成為檢測違禁添加藥物的重要手段。該方法對添加物的檢測無歧視，在合適的質譜條件下，可以獲得其分子離子及碎片的信息，對推斷未知物很有尤為重要，LC-MS/MS通過定性離子與定量離子能對未知物進行準確定量。近年來，LC-MS/MS技術在獸藥制劑中氯霉素、硝基呋喃類藥物、磺胺類藥物、硝基咪唑類藥物及喹諾酮類藥物的檢測均有報道[11-14]。

喹諾酮類及磺胺類藥物是水產和畜牧養殖中常用的廣譜抗菌藥物，也是常見的非法添加藥物；孔雀石綠、金剛烷胺與金剛乙胺屬于禁用藥物，這些藥物在動物體內殘留及代謝，會對人類健康造成一定傷害。獸藥制劑基質種類多，如預混劑、可溶性粉劑、獸藥散劑、注射液等，不能直接采用常規的飼料或動物源中獸藥殘留檢測分析技術進行檢測，因此建立一套有效的獸藥制劑中多種獸藥殘留分析方法非常重要。

研究建立了獸藥制劑中喹諾酮類、磺胺類、孔雀石綠、金剛烷胺等26種藥物的高效液相色譜串聯質譜法，該方法簡單快捷，靈敏度高、結果準確可靠，可滿足市場獸藥制劑中多種藥物的篩查需求，為獸藥監管提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC MS-8050 高效液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源及LabSolution LC MS數據處理系統(日本Shimadzu公司)；快速混勻器SK-1(金壇市中大儀器廠)；高速冷凍離心機GL-21B(上海安亭科學儀器廠)；氮吹儀QGC-36T(上海全島公司)。

1.2 藥品與試劑 氧氟沙星、諾氟沙星、甲磺酸培氟沙星、鹽酸環丙沙星、洛美沙星、甲磺酸達氟沙星、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星、氟甲喹、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、甲氧芐啶、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、金剛烷胺、金剛乙胺，26種化合物標準物質均購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度均大于99.0%。甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，購自德國Mecrk公司。實驗所用水為經Milli-Q凈化系統(美國Millipore公司)制備的超純水。試驗所用獸藥制劑樣品均為市售合格樣品，分別為20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、10%恩諾沙星可溶性粉、25%維生素C可溶性粉。

1.3 色譜及質譜條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱CAPCELL PAK C18(100 mm×2.0 mm，3 μm)；柱溫40 ℃；流動相A相為5 mmol/L甲酸-甲酸銨，B相為甲醇-乙腈(1∶1,V∶V)；線性梯度洗脫程序：0～2 min，90% A；2～3 min，85% A；3～13 min，85% A；13～20 min，15%A；20～25 min，15% A；25.10 min恢復初始比例，90% A，保持至28 min；流速為0.200 mL/min；進樣體積為1 μL。

1.3.2 質譜測定條件 電噴霧離子源，正離子掃描；多反應監測模式；離子源接口電壓4.5 kV；霧化氣流速3 L/min；干燥氣流速10 L/min；加熱器流速10 L/min；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；接口溫度300 ℃；碰撞誘導電離氣體壓力270 kPa，各化合物質譜采集參數見表1。

1.4 標準溶液的制備

1.4.1 單標標準儲備液的制備 分別精密稱取5 mg(精確至0.01 mg)26種化合物標準物質于各自的5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的單標標準儲備溶液，于-20 ℃以下避光冷凍保存。

1.4.2 26種化合物混合標準儲備液的配制 分別精密稱取5 mg(精確至0.01 mg)26種化合物標準物質于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的26種化合物混合標準儲備溶液，于-20 ℃以下避光冷凍保存。

1.4.3 26種化合物混合標準工作液的配制 準確移取0.1 mL 26種化合物混合標準儲備液(1 mg/mL)至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成 10 μg/mL的26種化合物混合標準工作液，于4 ℃避光冷藏保存。

1.4.4 26種化合物混合標準曲線的配制 精密移取適量26種化合物10 μg/mL混合標準工作液，用甲醇水(1∶1，V∶V)溶液稀釋，配制成質量濃度分別為0.1、0.2、1、2、10 ng/mL的混合標準工作曲線。

1.5 獸藥制劑前處理 準確稱取1.00 g(精確至0.01 g)獸藥制劑于50 mL塑料離心管中，加10 mL 0.2%甲酸乙腈超聲提取10 min，置于振蕩器振蕩30 min，8000 r/min離心5 min，移取2 mL上清液于氮氣吹干儀中濃縮至干，用1 mL甲醇溶解殘渣，加1 mL 0.2% 甲酸水溶液，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜得到預備液。為避免獸藥原藥對質譜的污染，預備液經甲醇:水溶液(1∶1,V∶V)稀釋10000倍后，經LC-MS/MS測定。

1.6 檢出限與定量限 選取20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉作為空白樣品，在空白樣品添加適量的26種化合物混合標準儲備液，按1.5方法處理樣品，經1.3方法儀器條件進行測定。依據特征離子質量色譜峰信噪比S /N≥3 的濃度為方法檢出限(LOD)，S /N≥10 的濃度為方法定量限(LOQ)。

1.7 精密度與準確度 采用標準添加法進行加標回收實驗。分別在20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉樣品中添加LOD、LOQ及5倍LOQ三個濃度水平的26種化合物混合標準儲備液，添加濃度見表3。按1.5方法處理樣品，經1.3方法儀器條件進行測定。每個添加濃度進行5個樣品的平行試驗，計算平均回收率及相對標準偏差。

1.8 實際樣品的測定方法 選取市售合格的獸藥制劑樣品，分別為20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、10%恩諾沙星可溶性粉、25%維生素C可溶性粉按照1.5方法處理，經1.3方法儀器條件進行測定。

表1 26種化合物質譜參數及保留時間Tab 1 Retention time and main mass spectrometry parameters of 26 compounds

2 結果與分析

2.1 線性范圍 按1.4.4方法配制的26種化合物混合標準工作曲線在1.3方法儀器條件下測定。26種化合物混合標準溶液(10 ng/mL)總離子流圖見圖1，26種化合物出峰順序及保留時間見表1，26種化合物分離度良好，響應靈敏。以各化合物定量離子色譜峰面積A為縱坐標，各化合物質量濃度(ng/mL)為橫坐標，繪制26種化合物的線性回歸方程。結果表明：26種化合物在0.1～10 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數r2均大于0.99，26種化合物的線性回歸方程及相關系數見表2。

2.2 檢出限與定量限 20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉作為空白樣品經1.5方法處理后，測定結果表明：在相應的保留時間，空白樣品及試劑空白對26種目標化合物無干擾，空白樣品圖譜及試劑空白圖譜見圖2。依據特征離子質量色譜峰信噪比S /N≥3 的濃度為方法檢出限，該方法檢出限為0.01 mg/g，特征離子質量色譜峰信噪比S /N≥10 的濃度為方法定量限，方法定量限為0.02 mg/g。

2.3 精密度與準確度 依據1.7方法制備添加濃度分別為0.01 mg/g、0.02 mg/g、0.1 mg/g的陽性樣品，每個濃度水平下平行測定5次，外標法標準曲線定量，26種化合物的平均回收率為70.0%～101%，相對標準偏差(RSD)為1.9%～8.8%，結果見表3。圖3為添加濃度為0.1 mg/g獸藥制劑陽性樣品圖譜。

2.4 實際樣品的測定 對市售的20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、10%恩諾沙星可溶性粉、25%維生素C可溶性粉分別進行HPLC-MS/MS檢測。結果表明：20%氟苯尼考粉、30%氟苯尼考可溶性粉、25%維生素C可溶性粉均未檢出26種化合物。10%恩諾沙星可溶性粉獸藥制劑除標稱“恩諾沙星”檢出外，其余25種化合物未檢出。經測定，10%恩諾沙星可溶性粉獸藥制劑中恩諾沙星含量為105 mg/g(有效含量為10.5%)，與產品標識含量(10%恩諾沙星)一致。圖4為10%恩諾沙星可溶性粉圖譜。

表2 26種化合物線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限Tab 2 Regression equation,correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of 26 compounds

表3 26種化合物在陽性樣品中的回收率(n=5)Table3 Recoveries of 26 compounds in different positive samples (n=5)

續表3

圖1 26種化合物混合標準溶液(10 ng/mL)總離子流圖Fig 1 Total ion flow chromatograms of 26 compounds (10 ng/mL)

圖2 (A)20%氟苯尼考粉樣品空白(B)30%氟苯尼考可溶性粉樣品空白(C)溶劑空白圖譜Fig 2 Chromatograms of blank samples (A) 20% florfenicol powder (B) 30% florfenicol soluble powder)and(C) solvent blank

圖3 獸藥制劑陽性樣品(添加量為0.1 mg/g)圖譜Fig 3 Chromatograms of spiked sample(0.1 mg/g)

圖4 實際樣品檢測(10%恩諾沙星可溶性粉)圖譜Fig 4 Actual sample test (10% enrofloxacin soluble powder)

3 討論與結論

3.1 色譜條件的優化 研究選用CAPCELL PAK C18(100 mm×2.0 mm，3 μm)色譜柱對26種化合物進行分離，依據目標化合物的性質，流動相均選用酸性溶液，如0.1%甲酸水，乙酸銨溶液、甲酸-甲酸銨復配溶液。本研究考察了甲醇-乙腈(1∶1,V∶V)作為有機相時，選取0.1%甲酸水、5 mmol/L乙酸銨及5 mmol/L甲酸-甲酸銨作為水相，采用梯度洗脫的方式對26種化合物進行分離。研究結果表明，當選用5 mmol/L甲酸-甲酸銨作為水相時，26種化合物的分離度及峰形優于0.1%甲酸水和5 mmol/L 乙酸銨溶液。

3.2 質譜條件的優化 方法采用不接分析柱的方式向質譜系統注入 1 μg/mL的混合標準溶液，進樣量為1 μL。確定各化合物的最佳質譜條件，包括離子源溫度、毛細管溫度、加熱模塊溫度、加熱氣流速、干燥氣流速、氮氣流速、選擇特征離子對、Q1和Q3的電壓、碰撞能量等質譜分析條件。各化合物標準溶液經高效液相色譜流動相混合后注入ESI電離源，進行一級全掃描質譜分析。在正離子模式下對[M+H]+進行子離子掃描，得到主要的子離子，并選擇響應值高的子離子進行碰撞能量優化，最終確定了多反應監測的離子對及碰撞能量，建立的質譜參數見表1。

3.3 提取溶劑的選擇 獸藥制劑基體復雜，含有大量的鹽及表面活性劑。試驗為避免獸藥粉劑中有機鹽份的干擾，選用甲醇、乙腈、0.2%甲酸乙腈3種提取溶劑對30%氟苯尼考可溶性粉陽性樣品(添加濃度為0.1 mg/g)進行提取試驗。選用甲醇和乙腈作為提取溶劑時，甲氧芐啶與磺胺類藥物的平均回收率較高，為80.2%～99.4%，喹諾酮類藥物的平均回收率為60.5%～80.2%，金剛烷胺與金剛乙胺的平均回收率為58.9%～70.6%，孔雀石綠與隱色孔雀石綠的平均回收率為66.2%～81.6%；選用0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑時，甲氧芐啶與磺胺類藥物的平均回收率為78.2%～95.2%，喹諾酮類藥物的平均回收率為90.6%～101%，金剛烷胺、金剛乙胺、孔雀石綠與隱色孔雀石綠的平均回收率為83.5%～97.6%。因此本試驗選用0.2%甲酸乙腈作為獸藥制劑的提取溶劑。

高效液相色譜-串聯質譜法應用于獸藥非特定非法添加物質的檢查，其檢出限能達到1 μg/kg(十億分之一)，甚至更低。然而，同一車間同一流水線生產不同品種的獸藥，盡管經過清場及清洗設備，還是會有少量的藥物殘留，一般這種殘留是極低且不均勻。高效液相色譜-串聯質譜法應用于獸藥非特定非法添加物質的檢查時更要注意選取的提取溶劑對獸藥原藥的提取效率，防止獸藥原藥對質譜造成污染，因此，經LC-MS/MS測定前用適當溶劑稀釋后再上機測定。

目前，我國獸藥非法添加物質檢查的檢測標準暫無判定限，僅要求給出檢測方法的檢出限或定量限。農業農村部頒布諸多公告多為高效液相色譜配二極管陣列檢測法(HPLC-PDA)，其檢出限在1 mg/g左右。研究建立了高效液相色譜-串聯質譜法同時快速測定獸藥制劑中喹諾酮類、磺胺類、孔雀石綠及金剛烷胺26種藥物的方法，且檢出限低(0.01 mg/g)。26種藥物在較寬的濃度范圍內線性關系良好，該方法操作簡單、重復性好，方法靈敏度高，能對獸藥粉劑中常規添加藥物及禁用藥物進行快速篩查和準確定量。研究為獸藥制劑中多種非特定添加藥物快速篩查和定量提供了參考，為行政監管部門提供了可靠的技術支撐。