國內外獸用生物制品無菌檢驗方法的比較分析

劉 博，魏 津，馬 欣，王 甲，李俊平，羅玉峰

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

無菌檢驗是獸用生物制品質量控制的重要檢驗項目，關系到獸用生物制品的安全性，準確的檢驗結果不僅能夠客觀公正地評價相關制品的質量，還能夠為生產企業提供技術參考，為行業監管和行政決策提供堅強的依據[1]。提高無菌檢驗敏感性，降低無菌檢驗操作難度，進一步優化現有無菌檢驗方法不僅可為行業內獸用生物制品生產企業提供便利，還可進一步保障獸藥安全、促進養殖業發展。本文從無菌檢驗的依據、培養基及培養條件、培養基質量控制、無菌檢驗的具體方法幾個方面，對國內外主流獸用生物制品無菌檢驗方法進行比較分析，以探討影響無菌檢驗結果的因素，為無菌檢驗方法的優化提供參考。

1 無菌檢驗依據

中國獸用生物制品無菌檢驗依據現行《中國獸藥典》2020年版三部[2]；歐盟國家獸用生物制品無菌檢驗依據《歐洲藥典》10.0版[3]，且人藥和獸藥無菌檢驗遵循一致依據；美國獸用生物制品無菌檢驗依據《美國聯邦法規》第九卷(9CFR)[4]，而人藥無菌檢驗依據《美國藥典》第19版，但是9CFR中明確規定，無菌檢驗培養基的質量控制需遵守《美國藥典》相關規定。

2 無菌檢驗培養基及培養條件

2.1 培養基種類 現行《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中無菌檢驗培養基相同之處在于均使用兩種常規培養基，分別是硫乙醇酸鹽流體培養基(TG)及胰酪大豆胨液體培養基(TSB)。其中，TG培養基主要用于厭氧菌和需氧菌的檢查，TSB培養基主要用于真菌及需氧菌的檢查。

2.2 培養基配方 現行《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中無菌檢驗培養基的配方有所區別。《中國獸藥典》TG和TSB培養基配方唯一。《歐洲藥典》中TG培養基有兩種，一種與中國獸藥典中所列TG培養基配方一致，另一種省略了瓊脂和刃天青溶液。9CFR中TG培養基有兩種，一種與中國獸藥典中所列TG培養基配方一致，另一種額外添加了0.5%牛肉膏。此外，《中國獸藥典》另使用酪胨瓊脂培養基(GA)用于需氧菌的檢查，9CFR中另使用腦心浸液瓊脂用于真菌和需氧菌的檢查。

2.3 培養條件 《中國獸藥典》中規定，TG及GA培養基的培養溫度是35～37 ℃及23～25 ℃，TSB培養基的培養溫度是23～25 ℃；歐洲藥典規定TG培養基的培養溫度是30～35 ℃，TSB培養基的培養溫度是20～25 ℃，對于含汞類防腐劑的獸用生物制品，用TG替代TSB置于20～25 ℃培養；9CFR規定TG培養基的培養溫度是30～35 ℃，TSB培養基的培養溫度是30～35 ℃或者20～25 ℃，對于含汞類防腐劑的獸用生物制品，用TG替代TSB置于20～25 ℃培養。三種方法版本的無菌檢驗用培養基及培養溫度見表1。

表1 無菌檢驗用培養基及培養溫度Tab 1 Culture media and culture temperature of sterility test

3 無菌檢驗培養基質量控制

國內外無菌檢驗培養基質量控制的要點均為無菌檢驗和微生物促生長能力。

3.1 無菌檢驗 《中國獸藥典》要求將三種培養基均分別置于35～37 ℃及23～25 ℃培養7 d，《歐洲藥典》及9CFR要求將TG和TSB分別置于30～35 ℃及23～25 ℃培養14 d，未發現有菌生長后方可使用。對于抽檢比例，《中國獸藥典》規定每批培養基隨機抽取10支(瓶)，《歐洲藥典》及9CFR僅要求抽取部分培養基進行無菌檢驗，具體數量未做要求。

3.2 微生物促生長能力 《歐洲藥典》及9CFR使用6株質控菌種控制培養基質量，菌種代次不得超過5代；《中國獸藥典》使用5株質控菌種，與《歐洲藥典》及9CFR相比少一株枯草芽孢桿菌，質控菌種代次無具體要求。《歐洲藥典》及9CFR具體規定如下：取不超過100 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌菌種懸液分別接種TG培養基，于30～35 ℃培養不超過3 d；取不超過100 CFU的白色念珠菌、巴西曲霉、枯草芽孢桿菌菌種懸液分別接種TSB培養基，于20～25 ℃培養不超過5 d；若有菌生長，則培養基微生物促生長能力符合要求。《中國獸藥典》中規定，取不超過50 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌菌種懸液分別接種TG培養基，于35～37 ℃培養3 d；取不超過50 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌種懸液分別接種GA培養基，于35～37 ℃培養3 d；取不超過50 CFU的白色念珠菌、巴西曲霉菌種懸液分別接種TSB培養基，于23～25 ℃培養5 d；若有菌生長，則培養基微生物促生長能力符合要求。質控菌種信息見表2。

表2 微生物促生長能力試驗質控菌種表Tab 2 Strains of the test micro-organisms suitable for use in the growth promotion test and the method suitability test

其他常規質量控制參數中，《歐洲藥典》關于TG培養基裝量有特殊要求。TG培養基由于分為氧化層和厭氧層，要求儲存于密閉無菌容器內，且培養基的上層表面積和深度之間需要遵循一定比例，保證在培養結束時，培養基氧化層在培養基高度的一半以內。《中國獸藥典》與9CFR無上述要求。

4 無菌檢驗方法適用性檢測

《歐洲藥典》要求，對新制品進行無菌檢驗時或者檢驗方法有更改時，需進行方法適用性檢測(與檢品的無菌檢驗同時進行)。

4.1 膜過濾法適用性檢測 在將待檢樣品轉移至濾膜過濾后，在用于洗滌濾器的無菌稀釋液中加入不超過100 CFU的質控菌種。

4.2 直接接種法適用性檢測 在將待檢樣品接入培養基后，在培養基內加入不超過100 CFU的質控菌種。兩種方法適用性檢測均需用表2中所列的6種菌種分別進行。將所有的樣品在適宜溫度培養不超過5 d。如果待檢樣品管內質控菌種生長狀態與陽性對照一致，則說明該樣品在當前檢驗方法下無抗菌活性或者其抗菌活性已經被中和且符合要求，該方法可以直接應用；如果與陽性對照相比，待檢樣品管內質控菌種未見明顯生長，則說明該樣品的抗菌活性在當前方法下未被成功中和，當前方法需要進行修改并重新進行適用性檢測。

5 無菌檢驗操作方法

《中國獸藥典》和9CFR中，獸用生物制品無菌檢驗只有直接培養法，樣品的最小抽檢量和最小取樣量均需遵循表3規定。

《歐洲藥典》中，無菌檢驗用到的方法分別為膜過濾法和直接培養法。對于具體方法的選擇，《歐洲藥典》規定如下：只要檢品性質允許，在當前使用方法下無抗菌活性，均使用膜過濾法[5]。不論選擇哪種方法，樣品的最小抽檢量和最小取樣量均需遵循表4和表5規定。

表4 《歐洲藥典》樣品最小抽檢量Tab 4 Minimum number of items to be tested in EP

表5 《歐洲藥典》樣品最小取樣量Tab 5 Minimum quantity to be used for each medium in EP

5.1 膜過濾法 選擇濾膜孔徑不超過0.45 μm、截留微生物能力被驗證過的、濾膜直徑大小為50 mm的膜式過濾器。水溶性制品、油性制品以及稀醇制品選擇硝酸纖維素濾膜；濃醇制品選擇醋酸纖維素濾膜。如果改變濾膜直徑，稀釋液以及洗液的體積也需相應調整。過濾裝置和濾膜須保證自身無菌，且樣品在無菌條件下通過過濾裝置過濾，膜需要在無菌條件下取出并且放置于培養基內，或者可直接在無菌條件下將培養基加入到過濾裝置中并培養。

5.2 直接培養法 《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中無菌檢驗均涉及直接培養法，但具體操作有所差別，此部分主要闡述各標準中培養法的差異。

5.2.1 《中國獸藥典》直接培養法 樣品按表3進行抽樣后，半成品直接接種TG、TSB、GA小管培養3～7 d后判定結果。成品樣品經過50 mL TG小瓶增菌3 d，再移植至TG、TSB、GA小管繼續培養7 d后判定結果。

5.2.2 《歐洲藥典》直接培養法 按照表4及表5進行抽樣，取適量的樣品直接接種于培養基，除非有特殊規定，樣品接種量不低于培養基體積的10%。如果待檢樣品有抗菌活性，需用適宜中和劑中和其抗菌活性或者將樣品接入足夠量的培養基中以達到稀釋的作用。如果樣品的量大，則使用經過濃縮的、后續需稀釋的培養基就更為合適。如果有必要，可以直接將濃縮的培養基加到樣品的容器中。將接種樣品后的培養基培養不少于14 d。在培養期間觀察培養基。油苗需每天輕輕搖晃，但是需要注意為了保證硫鹽培養基的厭氧環境，搖晃培養基的頻率和振幅需控制在最小。

5.2.3 9CFR直接培養法 含0.5%牛肉膏的TG培養基、TSB培養基用于含梭菌類毒素、菌苗、以及菌苗-類毒素制品的無菌檢驗；含或者不含0.5%牛肉膏的TG培養基、TSB培養基用于其他滅活苗、細胞系、原代細胞及動物源材料的無菌檢驗。

病毒類活苗、原始毒種的無菌檢驗選用TSB培養基(檢測細菌和真菌生長均用TSB，培養溫度上進行區分)。需要保證樣品可能帶有的抑菌或者抑真菌活性被中和。

細菌類活苗、原始菌種的無菌檢驗選用TG(檢測細菌)和TSB(檢測真菌)培養基。凍干制品需按照瓶簽注明的頭份/羽份數用隨樣品攜帶的稀釋液或者無菌純水復溶。推薦每1000 頭份/羽份疫苗用30 mL水復溶。

除注射外其他給藥方式的雞胚源活疫苗，未檢測或者按照常規活苗檢驗方法檢測有菌生長時，選擇每毫升含500 Kinetic (Kersey)單位青霉素的腦心浸液瓊脂平皿進行檢驗。

6 討 論

6.1 無菌檢驗的依據 無外源細菌和真菌污染，是獸用生物制品安全應用的重要保障。無菌檢驗作為檢測制品是否污染外源細菌和真菌的檢驗參數，存在于所有獸用生物制品的質量標準中(《中國獸藥典》細菌類活苗中為純粹檢驗)[6]。無菌檢驗方法敏感性的高低，直接決定結果的準確性。中國和美國對于獸用生物制品的無菌檢驗均有單獨的規定且區分于人用藥品，而歐盟國家對于獸藥和人藥的無菌檢驗依據是一致的。考慮到檢驗成本、適用對象、產品工藝及劑型差別，適當的區分更有利于檢驗技術的推廣和開展。

6.2 無菌檢驗培養基的質量控制 無菌檢驗培養基的質量直接影響無菌檢驗結果。培養基質量的關鍵在于微生物促生長能力，《中國獸藥典》中檢驗方法與國外最大的區別在于用于TSB培養基質量控制的質控菌株只有白假絲酵母菌和巴西曲霉，少一株枯草芽孢桿菌。由于TSB培養基應用目的是檢測需氧菌和真菌的生長，因此使用枯草芽孢桿菌作為檢測TSB培養基促進需氧菌生長能力的質控菌株是有必要的。對于微生物促生長能力的檢測限，國外為培養基需檢出100 CFU的質控菌，而我國規定需能檢出50個CFU的質控菌，從這個角度來說，我國對于培養基質量要求相對更高。自身無菌也是控制無菌檢驗培養基質量的重點，國內與國外方法在這方面的差別在于培養時長，《中國獸藥典》中規定培養7 d，國外方法要求14 d。《美國藥典》和《歐洲藥典》分別于2000年和1998年將培養基的無菌檢驗周期從7 d修改為14 d，原因在于考慮到7 d的周期可能無法檢測到部分“生長緩慢”的微生物，這為我國無菌檢驗培養基質量控制提供了參考。此外，對于培養基的抽樣比例也有所區別。《中國獸藥典》規定每批次培養基隨機抽取10 支(瓶)進行檢驗，《美國藥典》和《歐洲藥典》規定抽取部分培養基進行檢驗，未明確具體抽檢數量。

6.3 無菌檢驗培養基種類及培養條件的選擇 《中國獸藥典》對于無菌檢驗培養基的選擇比較單一，而《歐洲藥典》和9CFR對于無菌檢驗培養基均做過適當調整，使培養基可以更適合于當前樣品的培養。《歐洲藥典》和9CFR中TG及TSB培養基常規培養溫度比《中國獸藥典》中規定的溫度略低，基于無菌檢驗的目的主要是檢測生產過程中可能污染的環境雜菌，此類雜菌可適應30～35 ℃以及20～25 ℃的培養條件，然而不同培養溫度對方法敏感性的影響還有待研究。《中國獸藥典》內無菌檢驗培養基裝量恒定，《歐洲藥典》和9CFR內無菌檢驗培養基裝量根據檢品不同而不同。理論上來說，充足的培養基更有利于潛在污染菌的生長。考慮到TG培養基的特性，《歐洲藥典》特地對其裝量表面積和深度有所規定，是為了保證檢驗結束時，培養基內仍能保證需氧和厭氧兩個環境，對于潛在污染菌的檢出是值得借鑒的規定。9CFR中對于不同制品，培養基和培養條件均有差別。比如對于病毒類活疫苗，就不再選用TG培養基。這一點可能基于病毒活疫苗生產過程中培養基和培養方式，不利于厭氧菌的生長，且有利于營養苛求需氧菌的生長，故選用TSB培養基在30～35 ℃培養以檢出樣品中潛在污染菌。對方法的細化有利于提高無菌檢驗方法的敏感性和準確性。近年來在檢驗過程中發現，TSB培養基無法檢出組織源制品中污染營養苛求菌(如副豬嗜血桿菌、鏈球菌等)，導致制品出現“假陰性”結果；或者因組織強毒污染導致無法客觀評價被檢疫苗的免疫效力。篩選出營養特性好的培養基用于特殊樣品的檢驗非常值得深入研究。

6.4 無菌檢驗方法 對于具體無菌檢驗方法的選擇，除《歐洲藥典》中列出且首選膜過濾法外，《中國獸藥典》和9CFR對于獸用生物制品均選用直接培養法[7]。直接培養法從儀器設備、操作難度、經濟成本方面來說都是優于膜過濾法的選擇，推廣簡單上手容易，更利于獸用生物制品生產企業對于技術的掌握。然而，膜過濾法通過對樣品中潛在污染菌的濃縮、培養，從檢驗結果的準確性來說更勝一籌。而對無菌檢驗方法控制上，9CFR中要求檢驗時需添加質控菌作為陽性對照，還需同時設置陰性對照。《歐洲藥典》除增加陰陽性對照外，在檢驗方法或者檢驗條件改變時還需進行方法適用性檢測保證體系的適用性。對方法的控制可有力確保單次結果的準確性，排除非樣品原因導致的檢驗結果異常。

《中國獸藥典》《歐洲藥典》及9CFR中對供試品的抽檢量各有規定，與本批制品的生產量直接相關，然而對于每一瓶樣品的接種量卻各有不同。《中國獸藥典》和9CFR中，樣品的接種量是固定的，與樣品分類有關而與本身裝量基本無關。《歐洲藥典》里，樣品的接種量和樣品裝量直接相關，且規定樣品接種量不能少于培養基裝量的10%。更為細致的接種量的選擇，對于保障結果準確性，減少漏檢率是有意義的。

《中國獸藥典》中對于成品的無菌檢驗均需按照接種-移植的步驟進行，國外方法均為一步培養，僅在觀察過程中由于疫苗的性質導致結果不易判定時才需進一步移植。統一接種-移植的步驟可以稀釋防腐劑或抗生素、減少培養基用量，但是增加了操作程序且稀釋了樣品用量，對于某些對營養要求高的菌類，用TG小瓶培養3 d可能導致為數不多的菌死亡，從而造成漏檢。

6.5 小結 無菌檢驗最早于1932年出現在《英國藥典》中，作為樣品安全性的重要指標，幾十年來世界各國對于其方法的優化和完善一直在進行[8]。通過對《中國獸藥典》《歐洲藥典》和9CFR系統的比較發現，我國獸用生物制品無菌檢驗方法仍然存在優化和探討的空間。從培養基、培養條件、接種方式進行優化和驗證，結合國情制定更為完善的無菌檢驗方法，對我國獸用生物制品的生產和管理具有重要意義。