芽孢桿菌特性及其在畜牧生態養殖中應用研究進展

曹樹威，余昌花，羅鮮青，魏 莎，蔣世強，鄧祝新，王英群，黃麗霞，唐承明，李美珍，李芳芳，王國利*

(1.廣西壯族自治區畜牧研究所，南寧 530001；2.廣西壯族自治區畜禽品種改良站 南寧 530001)

“綠色環保”是當代畜牧業的發展趨勢，化學藥品濫用、養殖糞污影響人畜健康的傳統畜牧業必將被無毒、無抗、無污的現代有機畜牧業逐漸取代。芽孢桿菌作為一類生物多樣性廣，功能全面，抗逆性強，安全無公害的微生物群體，目前芽孢桿菌制劑已在養殖替抗、益生因子飼料發酵、養殖環境污染治理和畜禽疫病防控等領域表現出較大的應用潛力。本文結合芽孢桿菌的研究進展，闡述芽孢桿菌制劑作為未來生態畜牧養殖和新型多功能獸藥開發的潛力。

1 畜牧生產常用芽孢桿菌的分類

目前，常用于畜禽、水產養殖領域的芽孢桿菌主要分為5大類(表1)，這些菌都歸于芽孢桿菌屬，但屬于不同的種，且都能夠在細胞中間位置或頂端產生抗逆性極強的芽孢；5類菌對氧氣不敏感，暫無研究報道嚴格厭氧的芽孢桿菌，對營養條件亦無特殊要求，易培養，繁殖速度快，能夠在極短時間內形成優勢菌群，且多具備生物奪氧機制，與其它菌的競爭優勢顯著，其自身能夠合成不同類型的生物活性物質，可抑制病原菌的生長；5類菌因不同的產酶特點及其他代謝特征，各具自身特異的優勢，被廣泛應用于畜牧和水產生態養殖各領域，推動現代畜牧業和水產業朝著綠色環保的方向發展。

表1 生產常用芽孢桿菌的分類Tab 1 Classification of Bacillus which are commonly used in production

2 芽孢桿菌主要益生機理

2.1 競爭占位優勢顯著 芽孢桿菌的競爭占位優勢，主要體現在營養競爭和空間位點競爭。芽孢桿菌對環境溫度、濕度、氧氣、酸堿度無嚴格要求，大大拓寬了其可生存環境的范圍，且能和其他微生物在定殖部位爭奪利用氨基酸、糖類、無機鹽、維生素、微量元素等菌體生長所必需的營養物質，因此營養競爭優勢顯著；另外，芽孢桿菌可以分泌嗜鐵素，產生鐵螯合物及鐵載體，螯合、汲取環境里的Fe3 +，從而達到和其他微生物競爭環境中鐵元素的目的[1]。

芽孢桿菌空間競爭優勢表現在其同病原菌競爭植物根部或腸道內黏附位點，抑制致病菌結合上皮細胞，形成占位優勢，保護宿主細胞。Bacon 等研究發現，玉米內生芽孢桿菌因可以和玉米病原菌(串珠鐮孢菌)競爭玉米相同的生態位點，大大降低了病原菌的致病性[2]。芽孢桿菌具有抗胃酸和消化酶的能力，可以順利進入腸道定植，形成優勢菌群。置換腸道致病菌的研究證明芽孢桿菌對腸道上皮的黏附力強，可以和病原菌競爭腸道上皮的附著位點[3]。

2.2 生物奪氧，形成益生腸道環境 芽孢桿菌進入腸道定植后，可快速生長繁殖，消耗腸道內游離氧，降低氧化還原電位，使腸道內形成厭氧環境；同時，枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌等芽孢桿菌還能夠產生有機酸，降低腸道內的pH值，形成酸性環境。厭氧、酸性腸道環境為雙歧桿菌等益生乳酸菌的快速繁殖創造有利條件，促進益生乳酸菌形成優勢菌，抑制沙門氏菌、大腸桿菌等病原菌。好氧芽孢桿菌與厭氧乳酸菌協同作用，形成腸道內益生微生態環境[4]。

2.3 合成抑菌物質 芽孢桿菌可以合成肽類、聚酮類、蛋白類生物活性物質，抑制細菌、真菌和病毒生長。肽類物質主要分為脂肽類和多肽類物質，脂肽類物質包括表面活性素、伊枯草菌素、泛革素等具有穩定理化性質的物質；多肽類物質是一類線狀、環狀或分枝狀的抗真菌類物質。脂肽類的主要作用機理是破壞細菌或真菌的細胞膜，使膜內物質釋放，細胞裂解，達到抑菌的目的，其相對常規抗生素無特定作用靶點，不易因病原菌的變異產生耐藥性。解淀粉芽孢桿菌R3分泌的surfactin類抗 菌脂肽通過改變細胞膜通透性破壞細胞膜，裂解細胞，抑制產生多重耐藥性的大腸桿菌[5]。伊枯草菌素、泛革素等都對絲狀真菌表現出強烈的抑制作用，聚酮類物質則對細菌表現出強烈的抗性。蛋白類生物活性物質主要包括細菌素及降解菌類細胞壁的酶類物質，其通過降解細胞壁，達到裂解細胞的目的。幾丁質酶是其中一種常見的可以降解絲狀真菌細胞壁的酶類。TasA(Transition-phase spore-associated antibacterial protein) 是另一類對革蘭氏陽性細菌和陰性細菌均有抑制作用的酶類[6]。

2.4 生物大分子降解酶類及益生因子豐富 芽孢桿菌常見的消化酶類包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、半纖維素酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、果膠酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、殼聚糖酶、堿性磷酸酯酶、單寧酶；富含纖維素、木質素，營養價值低的農副產品轉化成高營養飼料的難題是如何將纖維素、木質素等大分子糖類物質，在低能耗、無污染的前提下高效轉化為可直接利用的糖類物質，芽孢桿菌產生的纖維素酶、半纖維素酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶等酶類，具備聯合降解纖維素、木質素的功能，有望成為攻克此瓶頸問題的一個方向。另外，利用芽孢桿菌作為飼料添加劑，不僅可以補充畜禽機體的外源消化酶類，而且可以刺激機體內源消化酶的分泌，提高腸道消化酶活性[7]；單寧是存在植物中常見的一類抗營養因子，芽孢桿菌產生單寧酶，降解單寧[8]。芽孢桿菌不僅酶系發達，還能夠合成必需氨基酸、維生素、類胡蘿卜素及多種類型的生長因子。

2.5 適合遺傳改造，可構建新型獸藥菌株 芽孢桿菌具有完善的表達系統和分泌系統，已被用作外源蛋白表達的理想宿主，用以構建可表達、分泌多種酶類的基因工程菌。

Pspac和Pxyl啟動子系統是芽孢桿菌常用的表達系統，可利用整合載體、噬菌體載體及可獨立復制的質粒載體等3種載體作為表達載體。整合載體可嵌至芽孢基因組上，隨菌體染色體復制而復制，穩定性好，但不足的是拷貝數低，不利于目標產物的大量表達；質粒載體可獨立復制，質粒越小拷貝數越高，質粒越穩定，產物表達量越多，且芽孢桿菌可以接受來自多種微生物源的質粒，包括已發現的金黃色葡萄球菌的pUB110、pC194、pE194質粒，干燥棒狀桿菌的pTZ12質粒，乳酸菌的pWV01、pSH71質粒及桿菌的pAT1060、pLS11、pBAA1、Pls11、pBC16質粒[9]。芽孢桿菌具有200個潛在的可引導胞外蛋白分泌的信號肽序列及Sec途徑、Tat途徑、ABC、Com 途徑等至少4個蛋白質分泌途徑[10]。

3 芽孢桿菌制劑應用現狀

3.1 畜牧生態養殖無抗應用

3.1.1 提高養殖對象健康 Galagarza等利用枯草芽孢桿菌飼喂羅非魚，提高了羅非魚體內促炎癥因子的水平，增加免疫力[11]。王建超等用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合飼喂鯉魚，顯著提高了鯉魚的特異性和非特異性免疫性能[12]。吳夢郡等研究發現，凝結芽孢桿菌可以促進豬仔腸道生理結構的發育，增加空腸絨毛高度，改善腸道吸收功能[13]。郭森等聯合使用抗菌肽和地衣芽孢桿菌飼喂肉雞，顯著提高了肉雞的免疫器官指數，增強機體的免疫性能[14]。余魁等用凝結芽孢桿菌添加斷奶仔豬日糧，顯著提高了仔豬抗氧化能力，促進仔豬腸黏膜的生長發育(P<0.05)[15]。養殖實踐表明，飼喂動物添加芽孢桿菌可以促進機體免疫器官、腸道發育，提高機體的免疫力及抗氧化性能，改善機體的健康狀況，可作為益生因子添加日糧，促進養殖業健康、綠色發展。

3.1.2 防治畜禽、水產病害 張錦華等研究發現納豆芽孢桿菌能顯著抑制腸道致病菌，包括大腸桿菌、葡萄球菌和沙門氏菌[16]。鐘青萍等研究結果表明，納豆芽孢桿菌抗菌方式為殺菌，而不是抑菌，且其產生的抗菌活性物質在菌體生長穩定期達到最高值[17]。朱沛霽等用枯草芽孢桿菌飼喂感染腸炎沙門氏菌的雪山草雞，極顯著減少了雞肝臟、腎臟、盲腸黏膜等的沙門氏菌量，顯著提高雞對沙門氏菌的抵抗力[18]。褚文超等在雞日糧中添加地衣芽孢桿菌治療雞腹瀉，降低了腸道中的動膠桿菌數量，同時提高了益生的群擬桿菌的數量，使雞的腸道恢復至正常的微生物群落結構[19]。李海花等用枯草芽孢桿菌飼喂大腸桿菌感染的仔豬，發現枯草芽孢桿菌降低了TLR2、TLR4 表達量，減輕了機體的炎癥反應[20]。李寧等研究發現飼喂地衣芽孢桿菌的豬無一出現咳喘病癥，且腹瀉率降低了62.18%[21]。郝向舉等利用劑量為1.4×108CFU/g的地衣芽孢桿菌ESB3飼喂中華絨螯蟹，使中華絨螯蟹的增重率提高42.83%，同時，溶菌酶活性、血清酚氧化酶活性、超氧化物歧化酶活性分別提高48.03%、32.73%、9.04%，對嗜水氣單胞菌的抗性提高87.5%[22]。李靖等用枯草芽孢桿菌添加牛日糧，抑制胃液里彎曲菌屬、葡萄球菌屬等有害微生物的生長，提高了牛的免疫能力[23]。芽孢桿菌作為微生態替抗劑，已被廣泛用于畜禽、水產養殖領域，添加畜禽飼料飼喂后，抑制或殺滅機體內病原菌，減輕炎癥，預防或治療畜禽疾病，逐漸取代抗生素或其它化學藥品在養殖業中的使用，解決畜產品中抗生素或藥品殘留問題，降低抗生素濫用對環境造成的影響。

3.1.3 提高畜禽生產性能和產品的品質 郭瑞萍等將枯草芽孢桿菌添加至肉雞飼料，極顯著提高了肉雞日增重、屠宰率、免疫器官指數、胸腿肉的單不飽和脂肪酸量(P<0.01)[24]。霍永久等用芽孢桿菌 BM1259 制劑喂豬后，豬的日采食量相比對照提高3.67%，日增重提高2.42%[25]。Cheng等研究發現，用含地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的復合菌劑添加日糧喂豬，豬的烹煮損失率及臀肌丙二醛(MDA)量均顯著降低，提高了豬肉的品質(P<0.05)[26]。芽孢桿菌對畜禽生產性能及品質的提高，歸功于其酶系發達的優點；其分泌的豐富酶類，補充機體的外源消化酶，刺激機體產生更多內源消化酶，促進機體對營養物質的充分利用，提高機體的生產性能。

3.1.4 構建綠色養殖環境 糞臭素、氨氣、硫化氫、甲酚、吲哚類物質、揮發性脂肪酸等物質是養殖環境中的臭源物質，不僅直接影響畜禽健康，而且對周圍環境造成污染。丁文駿等利用巨大芽孢桿菌BM1259飼喂肉雞，極顯著降低了蛋雞排泄物的氨態氮、尿酸、尿素氮含量和脲酶活性(P<0.01)[27]。沈琦等從豬糞中篩選到的嗜熱解淀粉芽孢桿菌對豬糞NH3、H2S的降解率分別達到50.31%、31.09%，且能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[28]。王思佳等利用具有高蛋白酶、脂肪酶活性的枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌作復合菌劑，發酵雞、牛屠宰廢棄物，分解有機碳及臭源物質，降低氮損失及堆肥里的水分，獲得高品質有機肥[29]。曹煜成等研究地衣芽孢桿菌對凡納濱對蝦的糞便降解效果，發現COD和NO3-N的降解率分別達到60%和50%[30]。芽孢桿菌具備產生氨基轉移酶、氨基氧化酶、分解硫化物酶等復合酶的能力，在腸道內分解、氧化臭源物質，同時，抑制腐敗菌滋生。在實際使用過程中，可將芽孢桿菌作為益生因子飼喂動物，芽孢桿菌定植腸道后可從源頭分解臭源；同時，可將芽孢桿菌液體制劑噴灑至養殖環境，分解臭源，形成養殖環境的益生屏障，解決養殖欄舍空氣污染的問題。

3.1.5 促進集約環保新型無抗水產養殖業發展 可控環保型魚類養殖箱是一類集約型的生態循環養魚系統，集成了工廠、生態雙重模式，可通過調節供氧、水體循環及生物凈化、糞便沉淀分離等綜合措施達到集約、生態養魚的目的，常常用以經濟價值高、對養殖環境要求苛刻魚類的高密度養殖。可控環保型魚類養殖箱占用空間遠小于傳統的水產養殖，且可控性強，最大的優勢是利用微生物高效降解養殖水體中可溶的、不能被過濾掉的有機排泄物、氨態氮，徹底凈化養殖水體，實現養殖用水的循環利用。微生物降解是此循環系統的核心環節，目前常用于水體凈化微生物包括光合細菌、乳酸菌、芽孢桿菌、硝化細菌。光合細菌、乳酸菌適宜在厭氧靜態環境中使用，與本系統水的流動循壞及供氧系統相悖，不適合本系統使用；硝化細菌凈化水體效果雖好，但對附著介質要求嚴格，且穩定性較差，菌種制作技術要求高，成本相對高；芽孢桿菌是兼性厭氧菌，分泌的胞外功能酶類型多，對氧要求不嚴格，具備強的水體有機物凈化能力，是集約型養殖的理想菌。目前，芽孢桿菌在水產養殖領域已被廣泛用做水質凈化及水產動物的疾病防治。

3.2 益生因子飼料加工領域 利用芽孢桿菌發酵飼料提高營養，去除抗營養因子、毒素是目前飼料加工領域的綠色、環保的方法。Dai等利用枯草芽孢桿菌發酵豆粕后，顯著提高了豆粕中粗蛋白、可溶性蛋白、黃酮、總酚的含量(P < 0.05)[31]。閆亞婷等用枯草芽孢桿菌發酵玉米飼料，玉米的淀粉分解率提高，使可溶性糖含量提高1.72倍[32]。孫煥林等研究枯草芽孢對棉籽粕的發酵效果，發現發酵后棉籽粕的棉酚含量降低了88.84%，蛋白含量提高14.37%，蛋白小肽類物質由4.00%提高至12.40%，必需氨基酸的含量均提高，其中纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸各提高6.25%、3.52%、9.52%、8.45%、24.13%、9.52%[33]。張洪燕等用地衣芽孢桿菌發酵飼料桑，極顯著提高了飼料中粗蛋白含量，同時極顯著降低了粗纖維含量(P<0.01)[34]。魏立民等利用復合酪酸芽孢桿菌發酵木薯渣，顯著提高粗蛋白、粗脂肪、乳酸等物質的含量，顯著降低干物質、中酸性洗滌纖維(P<0.05)[35]。李紅亞等用解淀粉芽孢桿菌復合菌劑發酵玉米秸稈，24 d后木質素、纖維素、半纖維素分別降解了48.4%、30.5%和41.4%[36]。Supriyati等用解淀粉芽孢桿菌發酵米糠，3 d后粗纖維由10.62%將至7.79%，發酵的米糠添加肉雞日糧后，提高了肉雞的飼料利用率[37]。管維等利用含納豆桿菌、側胞桿菌、凝結芽孢桿菌、枯草桿菌等的復合菌劑發酵菜籽餅5 d后，纖維素、植酸、單寧等抗營養因子的降解率分別為93.74%、36.59%和14.75%[38]。田玉虎等研究枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等對黃曲霉毒素AFB1、玉米赤霉烯酮ZEN等霉菌毒素的降解效果，發現枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌對AFB1和ZEN的降解作用強，且枯草芽孢桿菌的降解效果優于地衣芽孢桿菌[39]。在畜不與人爭糧的前提下，農副產品等非糧生物質能源的開發是解決未來畜禽養殖飼料源問題的關鍵；生產實踐表明，芽孢桿菌具備將營養缺乏、不宜直接作為飼料的生物質能源轉化成營養型飼料的潛質。非糧生物質能源作為飼料開發不僅能夠拓寬飼料源，而且能夠解決傳統的秸稈焚燒或棄置的問題，間接改善環境。

4 芽孢桿菌制劑促進現代畜牧業可持續發展的模型分析

現代畜牧業必將朝著生態、立體、循環、可持續的方向發展，如圖1所示，飼料種植業、飼料加工業、養殖業和疫病防控構成一個可持續的循環體系，而芽孢桿菌益生功能顯著，對于這個循環的可持續發展起到了極其關鍵的作用。

生態畜牧業中，種植飼料土壤肥力的提高依靠芽孢桿菌微生物肥料，替代化肥使用，避免化肥濫用造成的環境失衡；針對土壤中有機污染及重金屬污染的問題，利用芽孢桿菌進行生物降解、吸附。種植所得飼料植物，經芽孢桿菌發酵提高營養，去除抗營養因子及毒素，分泌微生物益生因子，為畜禽、水產無抗生態養殖提供益生菌飼料；同時，利用芽孢桿菌直接添加飼喂，替代抗生素防治疾病，全面提高動物的免疫能力及生產性能。木質化程度過高的農作物秸稈、糠類副產物，可作為動物的墊料床，變廢為寶。墊料的鋪設延長了養殖欄舍清糞周期，減少了人力成本，墊料床混合動物糞便，經芽孢桿菌發酵，分解有機大分子及糞便的臭源物質，消除欄舍臭味，改善欄舍養殖環境，間接提高動物健康度。墊料床經發酵后，直接用作有機肥還田或者投放魚塘，塘泥是一類肥力深厚的物質，可用做土壤狀況的改良。至此，形成了“飼料生態種植→生態養殖→秸稈和糞污還田”的良性循環，無污染排放，無農藥、抗生素殘留，擺脫對化肥的依賴，實現農業綠色發展。因此，芽孢桿菌是助推現代畜牧業可持續發展的關鍵因素，必將在我國鄉村振興戰略中發揮重要作用。

圖1 芽孢桿菌促進的生態畜牧業循環發展模型Fig. 1 Development model of ecological animal husbandry cycle promoted by Bacillus

5 展 望

豬瘟、禽流感及其它多類畜禽病多由病毒的感染導致，芽孢桿菌雖可產生抑菌物質，抑制多種病原菌，提高動物抵抗力，但尚不能對病毒起到直接、高效的殺滅作用，根本原因是菌體不能直接合成靶向性強的抗病毒物質。當前，已報道的芽孢桿菌基因工程菌表達的外源基因多為乙醇脫氫酶、纖維素酶、半纖維素酶、堿性蛋白酶、淀粉酶等酶的合成基因及氨基酸、有機酸醇、維生素等物質合成途徑相關的調控基因，尚缺乏利用芽孢桿菌構建用作獸藥菌株的研究報道。未來，隨著動物血清里特異性抗體提純、鑒定技術的進一步發展，可開發能夠直接用作殺滅病毒的菌株。構建能表達特異性抗體的芽孢桿菌功能菌，利用芽孢桿菌體耐受性強、對氧要求不嚴格的優勢，既能在動物體內發揮常規的益生作用，又能產生特異性抗體，直接殺滅病毒，補充病弱動物體的免疫缺陷。另外，構建能表達病原物質的芽孢桿菌型疫苗，利用芽孢桿菌繁殖速度快，適應性強的優點，有望與酵母類工程疫苗、腺病毒類疫苗及滅活疫苗等互補，共同促進畜牧產業的健康發展。

微生物對畜牧生態養殖的發展至關重要。芽孢桿菌是一類群體龐大的益生微生物，第9版《伯杰氏細菌系統學手冊：原核生物分類綱要》共記述了35個屬及近源屬的409種芽孢桿菌。當下及未來的任務是進一步挖掘新的芽孢桿菌資源，在世界范圍內篩選自然環境中芽孢桿菌，建立地方特色芽孢桿菌資源庫，利用地方特色菌服務當地畜牧業的發展。隨著航天事業的發展，我國自主研發的空間站在未來將逐漸投入科研應用。利用太空各類輻射的復雜條件，在太空開展新功能或更強功能芽孢桿菌誘變、篩選研究，將會為芽孢桿菌的育種開辟新的途徑，進一步增強可用芽孢桿菌獸藥資源的多樣性，對畜牧業發展的前景不可估量。從目前的應用現狀可知，芽孢桿菌里的絕大多數菌是生物安全級別微生物，但長期的應用必會導致菌株的變異。負向變異菌株可能存在功能退化、具備致病性等缺點，這就要求我們在應用芽孢桿菌的同時，做好安全性監測，提前制定好應對負向變異菌株的措施，及時消除安全隱患，加強可持續利用的研究。