外泌體在肺癌診斷及預(yù)后中的價(jià)值探討

唐黎威 竺王玉 樂涵波

肺癌患者生存率低的主要因素包括缺乏早期有效診斷及預(yù)后不良，因?yàn)樵缙诜伟┑呐R床癥狀并沒有特異性，許多患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期，導(dǎo)致后續(xù)的治療也不甚理想。因此在病變早期及時(shí)得到診斷、治療，并對預(yù)后進(jìn)行監(jiān)測，才能獲得較好的療效，這對提高肺癌患者的生存率尤為重要。目前，低劑量螺旋CT 是一種較為有效的早期篩查方式，組織活檢則可以作為確診的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，但是這兩種方法仍存在一定的局限性，因此迫切需要開發(fā)新的檢測手段。液體活檢作為近年來出現(xiàn)的一項(xiàng)突破性技術(shù)，是一種非侵入式的血液檢測，主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA 以及外泌體的檢測[1-2]。目前，針對外泌體的研究越來越多，外泌體已經(jīng)逐漸成為在早期肺癌診斷和監(jiān)測預(yù)后等方面的研究熱點(diǎn)，因此探索肺癌外泌體將為肺癌的診斷和預(yù)后開拓新的視野。本文就外泌體中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及miRNA 作為肺癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物的研究進(jìn)展作一綜述。

1 外泌體概述

1983 年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，1987 年Johnstone 將其命名為“exosome”。外泌體是直徑約為30～100 nm 的雙膜杯狀囊泡，主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中。目前發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，如網(wǎng)織紅細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、T 細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，也可由非造血來源的細(xì)胞產(chǎn)生，如上皮細(xì)胞（腸上皮細(xì)胞）、施萬氏細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、間皮瘤細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，并可釋放到生物體液中，如唾液、血漿、尿液、母乳、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液和腹水等[1，3-5]，因此，外泌體獲取來源可有多種選擇。既往研究表明，外泌體可以作為信號(hào)物質(zhì)在靶細(xì)胞中傳遞，并且攜帶有多種蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等，這些生物活性分子被一層脂質(zhì)雙層膜所包圍，因此這些生物源在循環(huán)中就可免受降解，成為穩(wěn)定的傳遞信號(hào)分子，形成了一種全新的細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，可參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程。進(jìn)一步研究表明，外泌體的分泌運(yùn)輸主要通過兩種方式，其中一種形成、運(yùn)輸機(jī)制需要內(nèi)涵體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（ESCRT），ESCRT 由4 種蛋白質(zhì)組成，它在外泌體內(nèi)腔中包裝生物分子以及幫助外泌體從細(xì)胞中釋放出去等方面起著重要的作用；另一種分泌方式是ESCRT 非依賴性機(jī)制，這種外泌體分泌方式需要鞘脂（神經(jīng)酰胺）幫助[3，5-6]。現(xiàn)有的研究已經(jīng)證明腫瘤細(xì)胞分泌的大量外泌體所包含的特異性蛋白質(zhì)、核酸等可以反映親代細(xì)胞的特征，因此腫瘤來源的外泌體可以幫助探索外泌體在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、遷移侵襲、血管生成中發(fā)揮的作用，進(jìn)一步了解外泌體對腫瘤細(xì)胞的免疫抑制作用，以及分析外泌體在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性中的作用機(jī)制[4-5，7-8]。肺癌來源的外泌體具有上述特點(diǎn)，因此鑒定肺癌來源的外泌體成分可以為肺癌的診斷和監(jiān)測預(yù)后提供重要的臨床參考。

2 外泌體對于肺癌的診斷作用

2.1 外泌體相關(guān)蛋白質(zhì)與肺癌的診斷 外泌體是內(nèi)吞起源的多囊泡體，并且可由正常或病理狀態(tài)的細(xì)胞釋放，它的成分可以反映親代細(xì)胞的特征。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中所包含的蛋白質(zhì)、miRNA 以及脂質(zhì)等生物分子對于肺癌的診斷具有很大的價(jià)值[1-2]。其中，膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合蛋白、熱休克蛋白（HSP）、鳥苷三磷酸酶、多囊泡體生物發(fā)生蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、代謝酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和載體是外泌體中最常見的鑒定蛋白。另外，諸如四跨膜蛋白家族（CD63、CD81、CD9）、腫瘤易感基因101、調(diào)亡相關(guān)基因-2 受體蛋白和HSP 普遍存在于外泌體中，這些蛋白質(zhì)通常可以作為識(shí)別外泌體的標(biāo)志物[3，5，9-10]。已有研究表明，CD151、CD171 和四跨膜蛋白8（TSPAN8）這3種外泌體蛋白可以用來鑒別診斷肺癌患者，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)它們可以區(qū)別肺癌的組織學(xué)類型，高水平的外泌體CD151 與腫瘤的侵襲性相關(guān)，且CD151 和TSPAN8與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，外泌體CD171 則與肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[10-14]。另有研究表明，在唾液中檢測到的外泌體蛋白具有腫瘤特異性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者能夠在尿液中檢測到外泌體；對此，通過免疫組化染色檢測到原發(fā)性腫瘤中富含亮氨酸α-2 糖蛋白1（Lrg1）的高表達(dá)與尿液標(biāo)本中Lrg1 的存在呈一定程度上的正相關(guān)，這提示了尿液中外泌體的Lrg1 可能來源于原發(fā)性腫瘤組織，因此檢測尿液中外泌體的Lrg1 也可以作為診斷NSCLC 患者的潛在標(biāo)志物[3，9，13-17]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)絲甘蛋白聚糖、原肌球蛋白3、血小板反應(yīng)蛋白以及含有HECT 結(jié)構(gòu)域的E3 泛素連接酶在作為區(qū)分肺腺癌的生物標(biāo)志物時(shí)具有較強(qiáng)的特異性。綜上研究表明，外泌體相關(guān)蛋白質(zhì)在肺癌的診斷方面具有巨大潛力。

2.2 外泌體脂質(zhì)與肺癌的診斷 在外泌體中檢測到的脂質(zhì)具有外泌體細(xì)胞起源的特征。外泌體富含有作為信號(hào)分子的脂質(zhì)，包括TC、TG、鞘磷脂、磷脂、甘油磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、聚甘油磷脂、前列腺素和白三烯以及相關(guān)的脂類代謝活性酶等。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與親代細(xì)胞相比，某些外泌體脂質(zhì)（鞘磷脂、甘油磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）的比例顯著升高，而且發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺對于外泌體的發(fā)生和觸發(fā)癌細(xì)胞死亡起到非常重要的作用，這可能提示了脂質(zhì)在外泌體的生物發(fā)生和在腫瘤微環(huán)境中的作用扮演了重要角色，影響了腫瘤的發(fā)展[5，9，19]。在一項(xiàng)研究中，研究人員使用了超高分辨率傅里葉變換質(zhì)譜法探討了NSCLC 患者血漿外泌體的脂質(zhì)譜，采集了39例健康體檢者和91 例NSCLC 患者（早期44 例，晚期47例）的血漿外泌體脂質(zhì)譜，使用兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法LASSO和RF 進(jìn)行分析，結(jié)果顯示使用所選特征脂質(zhì)的早期和晚期NSCLC 患者與健康體檢者相比，AUC 分別為0.79和0.77（LASSO）、0.85 和0.88（RF），成功地將健康體檢者、早期和晚期NSCLC 患者區(qū)分開來[19]。

2.3 外泌體相關(guān)miRNA 與肺癌的診斷 外泌體RNA因其高度的腫瘤特異性而具有很高的臨床診斷價(jià)值。miRNA 是短的（18～25 nt）、單鏈非編碼RNA，目前已證明外泌體miRNA 的表達(dá)與多種癌癥相關(guān)。研究表明肺癌患者的外泌體RNA 水平明顯高于健康者，且RNA水平與肺癌的進(jìn)展程度、治療反應(yīng)、生存率都密切相關(guān)。通過基因芯片、高通量測序法和qRT-PCR 等方法發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的外泌體miRNA 對NSCLC 的診斷有較大幫助。已有大量研究證明有12 個(gè)特異性外泌體miRNA（miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212和miR-214）是有助于篩選肺癌的生物標(biāo)志物[4-5，8，15，20]。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，NSCLC 患者分離的外泌體中發(fā)現(xiàn)有8 種miRNA（miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221 和miR-222）的表達(dá)存在差異[8]。最近有報(bào)道稱外泌體miRNA 能夠顯著區(qū)分肺癌患者組與健康對照組，并且發(fā)現(xiàn)在肺鱗狀細(xì)胞癌中，外泌體內(nèi)的5 種miRNA（miR-205、miR-19a、miR-19b、miR-30b 和miR-20a）水平可被用作診斷標(biāo)志物[6，8，14]。在另外一些研究中發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體中鑒定出的4 種miRNA（miR-378a、miR-379、miR-139-5p 和miR-200b-5p）在篩選和區(qū)分肺病變（肺腺癌和肉芽腫）患者和健康對照者中有一定意義[4]。此外，還有研究選擇了6 種外泌體miRNA（miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100 和miR-154-3p）來作為診斷標(biāo)志物以區(qū)分肺腺癌和肉芽腫，發(fā)現(xiàn)它們具有診斷意義[4，6，21，22]。一項(xiàng)前瞻性研究則探討了支氣管肺泡灌洗液外泌體miRNA 對于肺腺癌的早期診斷價(jià)值，評估了已知對肺腺癌有診斷價(jià)值的miRNAs（miR-7、miR-21、miR-126、let-7a、miR-17 和miR-19），其中發(fā)現(xiàn)miR-126 和let-7a 水平有明顯升高，進(jìn)一步證明了對于早期肺腺癌的診斷價(jià)值[23]。另有研究則探討了有利于肺癌診斷而不是非腫瘤性病因（如結(jié)核病）的miRNA（miR-205-5p、miR-483-5p、miR-375、miR-200C-3p、miR-429、miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-203a-3p 和miR-141-3p），發(fā)現(xiàn)具有診斷意義[17，22]。綜上所述，分析外泌體miRNA 可為探索早期肺癌診斷的分子標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

3 外泌體對肺癌的預(yù)后作用

3.1 外泌體蛋白質(zhì)對肺癌的預(yù)后 目前，肺癌的治療以手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療、分子靶向治療的綜合治療為主，但由于肺癌的晚期診斷和肺癌治療中的獲得性耐藥，導(dǎo)致患者預(yù)后往往較差，因此監(jiān)測肺癌患者預(yù)后尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，基于外泌體及其相關(guān)成分的研究對于監(jiān)測預(yù)后有重大意義。外泌體中有幾種與肺癌發(fā)展相關(guān)的蛋白，如表皮生長因子受體（EGFR）、鼠類肉瘤病毒癌基因（Kras）、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑、緊密連接蛋白和Rab 家族蛋白等，這些蛋白的表達(dá)與肺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，因此檢測外泌體中的此類蛋白表達(dá)可以幫助監(jiān)測預(yù)后。其他研究也表明膜蛋白CD91、CD317 和EGFR 是NSCLC 潛在的外泌體標(biāo)志物，并且發(fā)現(xiàn)在NSCLC 患者中紐約食管鱗癌蛋白1、EGFR 和人胎盤堿性磷酸酶水平增加，CD171 表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)，T 細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3 和半乳糖凝集素9這兩種蛋白質(zhì)則與腫瘤大小和分期相關(guān)，并有助于區(qū)分轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性NSCLC 的脂多糖結(jié)合蛋白[6，14，17，24-26]。另外，在一項(xiàng)相關(guān)研究中對NSCLC 外泌體蛋白組學(xué)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，EGFR、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白等含量均明顯增加，還發(fā)現(xiàn)在NSCLC 外泌體中肝細(xì)胞生長因子受體、Ras 相關(guān)的C3 肉毒素底物1 和Kras 蛋白水平均明顯增加[6，9，14-15]。還有研究結(jié)果表明，HSP 90、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、血管內(nèi)皮生長因子、Notch1 蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶2 在復(fù)發(fā)性腫瘤患者中的表達(dá)水平明顯高于原發(fā)性腫瘤患者，其中CCND1 是NSCLC 中研究最多的細(xì)胞周期蛋白之一，但由于其在肺癌患者預(yù)后中的作用在一些文獻(xiàn)報(bào)道中存在爭議，仍需要更進(jìn)一步研究進(jìn)行證明[20]。還有一項(xiàng)研究則探討了Rab 蛋白家族中的RabA 和RabB，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與肺癌轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)，特別是RabB 的高表達(dá)是肺鱗癌不良預(yù)后的因素之一，而RabA 則需要更進(jìn)一步的驗(yàn)證[27]。總之，上述外泌體蛋白質(zhì)的探索對于肺癌預(yù)后研究進(jìn)展具有非常重要的意義。

3.2 外泌體相關(guān)miRNA 對肺癌的預(yù)后 外泌體中的miRNA 是被用作監(jiān)測肺癌預(yù)后的一種重要生物標(biāo)志。相關(guān)miRNA（let-7、miR-221、miR-137、miR-372 和miR-182）的表達(dá)與肺癌患者的生存率有一定關(guān)系。研究證明，包括miR-486、miR-30d、miR-1、miR-499 在內(nèi)的miRNA的表達(dá)水平與疾病預(yù)后顯著相關(guān)，而在肺腺癌患者中，相關(guān)miRNA 在腫瘤組織中高度表達(dá)，表明了let-73、miR-25、miR-191、miR-34a、miR-34c 與患者預(yù)后相關(guān)。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-3、miR-96、miR-21、miR-95、miR-155 和miR-337-5p 在腫瘤復(fù)發(fā)患者中表達(dá)上調(diào)，特別是miR-21 和miR-155 表達(dá)呈顯著上調(diào)[20，24]。另一方面從NSCLC 復(fù)發(fā)患者分離出的外泌體中miR-21 和miR-4257 水平與無復(fù)發(fā)患者具有高度可比性，它們在疾病復(fù)發(fā)患者中的水平顯著上調(diào)，且這兩種外泌體miRNA 也與腫瘤的大小、組織類型和轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明這兩種外泌體miRNA 是可以作為NSCLC 患者復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物；相對的，與腫瘤抑制相關(guān)的兩種miRNAs，即miR-51 和miR-373 的外泌體表達(dá)在肺癌患者中降低，與患者不良預(yù)后相關(guān)[6，14，16，28-30]。EGFR 突變是NSCLC患者預(yù)后不良的最常見的一種因素，基于此有研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA（miR-25、miR-122、miR-195、miR-21和miR-125b）與EGFR 突變的NSCLC 患者對吉非替尼的敏感性有關(guān)，表明外泌體有可能對于患者的靶向治療選擇有一定幫助，而外泌體miR-221 和miR-222 與EGFR 突變患者對奧西替尼的良好治療反應(yīng)有關(guān)[8，17，26]。還有報(bào)道稱miR-23b-3p、miR-10b-5p 和miR-21-5p水平在NSCLC 患者中被證實(shí)是上調(diào)的，同樣證明其是有前景的預(yù)后生物標(biāo)志物，有待于更深入的研究[6，14，22，26]。另外在幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，研究者測定比較了肺癌患者和健康對照組間miRNA 表達(dá)的相對變化，發(fā)現(xiàn)在外泌體中相關(guān)miRNA（miR-30b、miR-30c、miR-103、miR-122、miR-195、miR-203、miR-221 和miR-222）呈高水平狀態(tài)，表明這些miRNA 作為肺癌的標(biāo)志物具有監(jiān)測預(yù)后價(jià)值[9]。綜上所述，分析外泌體中的相關(guān)蛋白以及miRNA對于肺癌患者的預(yù)后評估具有很大幫助。

4 小結(jié)

肺癌的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測是提高患者生存率的關(guān)鍵，得益于液體活檢這一項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展和成熟，外泌體作為液體活檢的對象之一，在各方面都具有很大的潛力。液體活檢與以往作為金標(biāo)準(zhǔn)的組織活檢不同，組織活檢是一種侵入性的檢查，具有一定的局限性（如腫瘤的異質(zhì)性和進(jìn)化、腫瘤組織無法獲取或不足以進(jìn)行完整的基因分析以及對于患者的侵入性風(fēng)險(xiǎn)等），液體活檢相對于傳統(tǒng)的手術(shù)活檢和穿刺活檢相比，優(yōu)勢在于它是一項(xiàng)非侵入性的技術(shù)，對患者的不良反應(yīng)更小，可以重復(fù)獲取樣本，且成本更為低廉。然而，目前對于外泌體的研究仍存在以下幾個(gè)問題：（1）外泌體作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其在NSCLC 的進(jìn)展過程中的具體作用機(jī)制尚不清楚，外泌體可以在肺癌細(xì)胞及其微環(huán)境之間轉(zhuǎn)移具有生物活性的分子，但是其能準(zhǔn)確將這些生物分子遞送到特定靶細(xì)胞的機(jī)制仍需要闡明；（2）外泌體在NSCLC 診治中的靈敏度和特異度有待提高；（3）由于目前技術(shù)的限制和較高的研究成本，獲得大量的、高純度的外泌體及外泌體全面表征仍具有挑戰(zhàn)性，這也將影響臨床應(yīng)用、生物醫(yī)學(xué)研究和生產(chǎn)成本，因此需要結(jié)合多種分離技術(shù)來優(yōu)化外泌體的分離及富集；（4）外泌體的定量、純化和保存尚未標(biāo)準(zhǔn)化，這對實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果產(chǎn)生一定影響；（5）外泌體是一種很有前景的肺癌診斷、監(jiān)測預(yù)后以及實(shí)時(shí)監(jiān)測治療效果的生物標(biāo)志物，但目前的研究樣本量通常較少，重復(fù)性較差，因此需要大型的多中心研究提高液體活檢的有效性；（6）外泌體用于靶向治療的不良反應(yīng)目前還尚未明確。基于上述問題，仍需要對外泌體作為肺癌診斷標(biāo)志物進(jìn)行大量驗(yàn)證和分析。隨著對外泌體生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能及其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中機(jī)制的進(jìn)一步研究和更深入的理解，相信外泌體作為液體活檢的對象之一及蛋白質(zhì)、DNA 及RNA 等穩(wěn)定遺傳物質(zhì)的可靠來源，可以為肺癌的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測提供新的策略。