SARS-CoV-2 S蛋白及其受體血管緊張素轉換酶2的研究進展

丁海麥 李彩艷 閆巧梅 張學明

2019年12月，新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情在武漢暴發。新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）利用S蛋白S1亞基與人細胞血管緊張素轉換酶2（HACE2）結合，通過宿主蛋白酶激活S2亞基，介導病毒進入宿主細胞，其傳染性、致病性較非典型肺炎病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）更強，其中S蛋白在很大程度決定了該病毒的組織嗜性和致病性[1-2]。目前對SARSCoV-2的研究熱點主要集中在S蛋白、血管緊張素轉換酶2（ACE2）結構及S蛋白介導進入宿主細胞機制等，本研究對SARS-CoV-2 S蛋白及其受體ACE2的最新研究進展作一綜述。

1 SARS-CoV-2

冠狀病毒是一類具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子形狀不規則，直徑約60～220 nm，外包膜有蘑菇狀蛋白刺突；可分為Letovirinae和冠狀病毒兩個亞科，其中冠狀病毒亞科又分為α-CoV、β-CoV、γ-CoV、δ-CoV等4個屬，蝙蝠、鼠類、鳥類、家禽和家畜等都是冠狀病毒宿主，其中蝙蝠是最主要的自然宿主，所攜帶的病毒約35%為冠狀病毒。多數冠狀病毒對人和動物具有致病性，α-CoV、β-CoV可引起人類和哺乳動物呼吸道、腸道及中樞神經系統感染，γ-CoV、δ-CoV主要感染禽類。目前可感染人類的冠狀病毒僅有 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoVHKU1、SARS-CoV、MERS-CoV[3]和 SARS-CoV-2，其中SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV-2的致病性及傳播力較強。

根據前3個測定的SARS-CoV-2基因組序列對其基因組注釋，SARS-CoV-2基因組有14個ORF編碼27種蛋白。基因組5'末端的orf1ab和orf1a基因分別編碼pp1ab和pp1a蛋白，這兩種蛋白包含15種非結構蛋白（nsp，具體為 nsp1～nsp10，nsp12～nsp16）；基因組3'端編碼4種結構蛋白（刺突蛋白S、包膜蛋白E、基質蛋白M和核衣殼蛋白N）和8種輔助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b 和 orf14）。與數據庫相關冠狀病毒進行比較，氨基酸水平上SARS-CoV-2與SARSCoV非常相似，但有一些明顯差異，如8a蛋白存在于SARS-CoV中，而SARS-CoV-2中則無；8b蛋白在SARSCoV中為84個氨基酸，而SARS-CoV-2中則為121個氨基酸；3b蛋白在SARS-CoV中為154個氨基酸，而在SARS-CoV-2中則只有22個氨基酸。基于全基因組的系統進化樹表明，SARS-CoV-2與人CoV、MERSCoV、蝙蝠CoV、SARS樣蝙蝠CoV和SARS-CoV處于同一β冠狀病毒演支，SARS-CoV-2在整個基因組序列方面更接近SARS樣蝙蝠CoV，基因組與SARS樣蝙蝠CoV（MG772933）的基因組相似度最高，SARSCoV則由SARS樣蝙蝠CoV進化而來，甚至SARSCoV-2與Bat-SL-CoVZC45的nsp7和E蛋白氨基酸序列完全相同，表明蝙蝠可能是SARS-CoV-2的宿主[4]。

2 ACE2

SARS-CoV-2細胞受體ACE2是羧肽酶ACE的同源物，羧肽酶生成血管緊張素Ⅱ，是腎素-血管緊張素系統（RAS）的主要活性肽。目前認為ACE2主要功能有負調節RAS、參與腸腎中性氨基酸吸收及SARSCoV-2與SARS-CoV進入細胞受體等。

2.1 RAS 在RAS中，ACE把腎素切割血管緊張素原產生的血管緊張素（Ang）Ⅰ再次切割成AngⅡ。AngⅡ是RAS的關鍵調節因子，可通過兩個G蛋白偶聯受體調節血管強效收縮、細胞生長、肥大細胞以及炎性細胞因子的分泌、導自由基的生成和氧化分解等生物學功能。

2000年發現了一種新的、與人類ACE相關的羧肽酶ACE2，該基因定位于X染色體p2段2，包含18個外顯子。ACE2由805個氨基酸組成，分子量約為120 kD，包含N端肽酶結構域（PD）和C端Collectrin樣結構域（CLD），CLD末尾有單個跨膜螺旋和一個含約40個殘基的細胞內段。ACE2可以降解AngⅡ為Ang1-7；還可以直接水解AngⅠ，產生無活性的Ang1-9肽，然后通過ACE或其他肽酶轉化為血管擴張肽Ang1-7；還可以對抗ACE與 AngⅡ，發揮舒張血管、抗組織纖維化、抗增殖和利尿等作用，對激活的RAS進行負調節[5]。此外，ACE2還可以通過ACE2/apelin信號發揮重要的心血管保護作用，參與細胞增殖、凋亡、分化、炎癥反應、氧化應激反應及血壓調控[6]。

2.2 ACE2及其同源物Collectrin轉運中性氨基酸BoAT1（SLC6a19）是腎臟和小腸上皮細胞主要的中性氨基酸轉運載體，BoAT1 mRNA在腎臟近端小管和小腸高表達，蛋白定位在小腸上皮細胞和腎臟近端小管上皮細胞刷狀緣。研究發現，促進ACE2表達可提高腸黏膜中性氨基酸轉運載體BoAT1的活性，從而增加中性氨基酸的轉運；進一步研究發現，只有BoAT1存在時，僅能低效率地轉運氨基酸，而與ACE2結合后，氨基酸轉運效率可增加至原來的10倍，提示 ACE2與BoAT1相結合并不能改變BoAT1對氨基酸的選擇性，但能極大地提高其對氨基酸的轉運速率[7]。定位于腎臟近端小管的刷狀緣ACE2的同源物Collectrin是一種非催化蛋白，它在腎近端小管中性氨基酸再吸收過程中起關鍵作用[8]。

2.3 S受體 SARS-CoV-2與SARS-CoV的S蛋白氨基酸同源高達80%，SARS-CoV的S多克隆抗體能有效中和SARS-CoV-2 S蛋白介導的細胞進入，說明兩者的S蛋白結構相似，推測SARS-CoV-2同SARSCoV一樣借助S蛋白與受體細胞ACE2結合進入細胞。BHK-21細胞系對SARS-CoV-2和SARS-CoV不敏感，正常情況下兩種病毒無法有效侵染BHK-21，當BHK-21表達ACE2后，ARS-CoV-2同SARS-CoV一樣能有效侵染BHK-21細胞[2]。

SARS-CoV-2與SARS-CoV受體都是ACE2，那么S蛋白如何結合ACE2？獲得ACE2在細胞膜上的穩定存在狀態有助于解決這一問題。ACE2為膜蛋白，很難在體外獲得穩定結構。有研究借助腸道內ACE2與BoAT1能夠形成穩定復合物，通過共表達獲得ACE2與BoAT1穩定復合物，用冷凍電鏡成功解析了ACE2-BoAT1三維結構，發現ACE2以二聚體形式存在，維持二聚體的作用力主要是兩個ACE2單體頸部結構域氨基酸殘基相互作用力，而PD之間的作用力很弱，這種弱作用力便于PD轉位而呈現出“開放”和“關閉”兩種構象[9]。無論是開放狀態還是關閉狀態，PD都能與S蛋白結合。因此，二聚體ACE2可同時容納兩個S蛋白三聚體，這種聚集作用有助于膜的內陷和病毒顆粒的內吞。ACE2的PD存在6個糖基化位點，其中Asn53、Asn90、Asn322三糖基化位在RBD結合位點附近，糖基化能使病毒逃過人體免疫細胞識別和攻擊。氯喹能干擾ACE2的末端糖基化，減少病毒與受體細胞膜上ACE2的結合，納入SARS-CoV-2治療方案[10]。此外，ACE2的C末端（特別697-716）存在TMPRSS2蛋白酶切割位點，ACE2與S蛋白結合后，TMPRSS2蛋白切割ACE2，有助于S蛋白驅動的病毒進入[11]。

借助ACE2單細胞表達水平，評估SARS-CoV-2除呼吸系統外對其他主要器官的潛在損傷。SARSCoV-2最主要的靶點是肺Ⅱ型肺泡上皮細胞（AT2）和巨噬細胞，其次是心肌細胞和腎上腺基質細胞，最后是睪丸、卵巢和甲狀腺的基質細胞。由于極化的腎近端小管細胞、肝膽管細胞和腸細胞ACE2定位在細胞的頂端區域，病毒不容易到達，不是SARS-CoV-2的主要靶器官。提示SARS-CoV-2患者除急性呼吸窘迫綜合征外，治療期間還應注意心血管系統、內分泌系統和生殖系統的潛在傷害[12]。

值得注意的是，當SARS-CoV S蛋白與ACE2結合后，導致ACE2水平下降，AngⅡ水平升高，RAS激活，進而導致免疫反應失衡，炎癥風暴啟動，迅速引起單器官或多器官功能衰竭，最終威脅生命。已有小鼠實驗表明，ACE2能改善SARS－CoV、酸吸入和敗血癥等引起的急性肺損傷，重組人ACE2能改善SARS-CoV引起的急性肺損傷[13]。最近研究發現，一部分人感染SARS-CoV-2后或受刺激性細胞因子（如干擾素）的刺激，ACE2表達顯著上升，加速SARS-CoV-2通過ACE2進入受體細胞，促進其復制和擴散[14]。關于干擾素治療SARS-CoV-2的利弊如何，仍需進一步研究明確。

3 S蛋白

冠狀病毒侵染受體細胞是一個復雜的過程，需要S蛋白與受體結合及宿主蛋白酶協同作用。S蛋白是位于病毒包膜表面呈刺突狀的高度糖基化、同源三聚體Ⅰ膜融合蛋白。S蛋白是由S1亞基和S2亞基組成。S1亞基含受體結合域（RBD），是決定細胞嗜性、宿主范圍和動物傳播的關鍵部分。S2亞基含有疏水性融合環和2個七重復區域（HR1和HR2），具有卷曲螺旋結構，介導病毒包膜和細胞膜的融合。在S蛋白特定位點切割是侵染宿主細胞的前提，對于多數冠狀病毒而言，在S蛋白S1和S2亞基之間的邊界區及S2'存在蛋白酶切割位點。常見的蛋白酶有跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS2）、組織蛋白酶 B/L（CatB/L）及Furin等。與SARS-CoV相比，SARS-CoV-2 S蛋白S1和S2亞基之間的邊界區多Furin位點，且兩者S蛋白結構不同。

3.1 S蛋白S1和S2亞基邊界Furin位點 比較SARS-CoV-2與SARS-CoV核苷酸序列發現，在SARS-CoV-2 S蛋白S1和S2亞基之間的邊界處插入PRRA的4個氨基酸殘基后，該位點可被Furin切割[15]。目前已測序的SARS-CoV-2分離株都存在Furin位點，而與其密切相關的RaTG13 S蛋白中卻沒有發現Furin位點。借Furin位點就可將SARS-CoV-2與SARS-CoV等冠狀病毒區分開來。

同其他Furin病毒一樣，SARS-CoV-2 S蛋白在生物合成過程中就被宿主高爾基體Furin在S1/S2邊界區切割。因此，在S1和S2亞基膜融合前構象中以非共價結合。SARS-CoV-2病毒包裝機制與埃博拉、HIV等一樣，而不同于SARS-CoV。進一步說明 S1/S2邊界Furin切割對SARS-CoV-2感染宿主細胞的影響，構建了缺少PRRA氨基酸殘基的S蛋白突變體（Sfur/mut）假病毒（MLV），突變體假病毒出芽時S蛋白沒有被切割，發現突變體假病毒侵染VeroE6細胞（不表達ACE2）效率高于野生型假病毒，而對轉染hACE2的BHK細胞的侵染效率則相反[16]。說明Furin切割主要不是參與S蛋白介導膜融合，而同其他高致病性禽流感病毒及MERS-CoV一樣，SARS-CoV-2 S蛋白包裝前Furin切割，有助于RBD與ACE2結合及隨后的TMPRSS2切割，擴大宿主趨向性及致病性。由于Furin幾乎在所有類型細胞中都表達，相比SARS-CoV，SARS-CoV-2宿主更廣，傳染性及致病性更強。

3.2 S蛋白與ACE2結合 不同種類的冠狀病毒借助S1亞基不同結構域來識別、附著受體。如人類冠狀病毒HCoV-OC43和HCoV-HKU1借助S1亞基結構域A結合宿主細胞表面的糖蛋白和糖脂上的5-N-乙酰基-9-O-乙酰基唾液酸苷感染易感細胞；MERS-CoV借助S蛋白N端結構域A先結合附著宿主細胞表面的唾液糖多和黏液蛋白，隨后結構域B與受體二肽基肽酶 4（DPP4/CD26）結合；而 SARS-CoV-2及 SARSCoV則通過S1亞基RBD直接與ACE2相互作用而進入靶細胞。RBD位于S1亞基C端306-575區域，其中424-494為受體結合基序（RBM）直接介導與ACE2的相互作用。盡管SARS-CoV-2及SARS-CoV S1亞基RBD結構相似，但在RBD與ACE2作用界面上發現十幾個氨基酸改變[17]。這些變化整體上增強了SARSCoV-2 RBD與ACE2之間的親和力。

冠狀病毒顆粒與受體細胞結合前，S蛋白通常以亞穩定的預融合狀態存在。為了接合受體，S1的RBD經歷鉸鏈狀構象運動，該構象運動不時隱藏或暴露RBD結合受體位點。這兩個狀態分別稱為“向下”構象和“向上”構象，其中向下對應于受體不可及的狀態，向上對應于受體可及的狀態。SARS-CoV S蛋白的3個RBD均處于“向下”構象，緊緊地包住鄰近的N末端結構域（NTD），無法結合ACE2。RBD通過鉸鏈狀構象運動從“向下”構象變為“向上”構象，該構象下RBD沒有空間位阻順利結合ACE2。而SARS-CoV-2處于“向下”構象的RBD的角度更靠近三聚體中心位置，其中3個RBD中的1個處于“向上”構象，與SARS-CoV相比SARS-CoV-2更容易與ACE2結合[18]。SARS-CoV-2 S蛋白與ACE2結合時，ACE2與1個向上構象的RBD結合導致3個RBD都形成不穩定“向上”構象。RBD與受體結合后破壞了S蛋白亞穩定狀態，導致S1亞基的脫落，S2'位點被宿主蛋白酶水解，S2亞基構象變化暴露出融合肽，隨后融合肽插入宿主細胞膜并與之融合，將核酸分子釋放進入胞內，完成侵染過程。

3.3 S蛋白介導SARS-CoV-2進入受體細胞 根據病毒和細胞類型不同，S蛋白與受體結合后，利用宿主TMPRRS2、CatB/L、Furin、胰蛋白酶等水解 S2 亞基暴露融合肽。這些蛋白酶在靶細胞上的有效性很大程度上決定了冠狀病毒是通過細胞膜還是內吞進入細胞。冠狀病毒S2亞基中存在兩個重要的保守重復氨基酸序列，即HR1和HR2，共同形成6-HB螺旋結構。6-HB在病毒包膜與宿主膜融合過程中起主要作用。

TMPRRS2是一類定位于細胞膜上具有保守絲氨酸蛋白酶結構域的蛋白酶，C端蛋白酶結構域在胞外，N端位于胞內。現已表明TMPRRS2是SARS-CoV及其他冠狀病毒細胞膜融合進入宿主細胞不可缺少的蛋白酶[19]。為了評估TMPRRS2對S蛋白驅動SARS-CoV-2侵染細胞的影響，用氯化銨提高細胞內環境PH抑制CatB/L活性，發現S蛋白驅動SARSCoV-2侵染293T細胞（不表達TMPRSS2）受到強烈抑制，而侵染Caco-2細胞（表達TMPRSS2）基本無影響。SARS-CoV-2同SARS-CoV一樣，S蛋白與ACE2結合后借助宿主TMPRRS2切割S2'，激活融合蛋白活性，誘導受體依賴性合胞體的形成[20]。

比較SARS-CoV-2和SARS-CoV與細胞膜融合效率，將分別表達SARS-CoV-2和SARS-CoV S蛋白的293T細胞與表達ACE2的293T細胞在合適的條件下共培養一段時間，結果發現如果S蛋白是SARSCoV-2的，就會出現合胞體；如果S蛋白是SARS-CoV的，就沒有合胞體；沒有S蛋白或者ACE2，也不會形成合胞體。與臨床結果一致，SARS-CoV-2 S蛋白介導的膜融合能力要更強，進入細胞的效率更高。分析原因，比較兩者S2亞基的HR1和HR2的氨基酸序列，發現兩者的HR2的同源性是100%，HR1有8個氨基酸不同[21]。SARS-CoV-2 HR1中8個氨基酸替換增強了HR1和HR2結構域之間的相互作用，進一步穩定6-HB結構，導致病毒包膜和細胞膜融合能力增強。

有研究利用構建的SARS-CoV-2假病毒轉染HEK293/hACE2細胞，分別用溶酶體抑制劑、氯化銨和bafilomycin A處理HEK293/hACE2細胞，評價不同內吞體宿主蛋白酶對病毒包膜與內吞體膜融合的影響，與對照組相比，20 mm NH4Cl和100 nm bafilomycin A處理HEK293/hACE2后，SARS-CoV-2假病毒侵染率減少98%以上[21]，這表明SARS-CoV-2假病毒主要通過受體依賴內吞進入HEK293/hACE2細胞。冠狀病毒選擇胞質膜還是內吞進入細胞，與相應蛋白酶在靶細胞上的有效性和靶細胞所處環境有關。

4 小結

SARS-CoV-2引發的疫情正在全球范圍內暴發，確診感染人數還在持續猛增中。SARS-CoV-2 S蛋白暴露于病毒表面并介導感染宿主細胞，S蛋白是感染后中和抗體的主要靶點，也是治療和疫苗設計的焦點。針對S蛋白RBM區域設計抗體，直接阻斷其與ACE2結合活性的效果更好，但RBM序列保守程度較低，針對RBM區域的交叉保護抗體可能更難獲得。RBM基序以外更保守區域的抗體具有交叉保護中和活性，缺乏ACE2阻斷活性，抗體可能不那么有效。目前以ACE2為靶點的老藥新用及利用重組人類ACE2蛋白中和SARS-CoV-2阻止SARS-CoV-2進入受體細胞，為治療和預防SARS-CoV-2感染提供了一種新方案。